一、应用MALDI-TOF-MS鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构（论文文献综述）
朱晓琳[1]（2016）在《Vγ9Vδ2 T细胞对骨髓瘤环境下未成熟树突状细胞转分化为破骨细胞的调控研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨Vγ9Vδ2 T细胞对未成熟树突状细胞（immature dendritic cell,imDC）向破骨细胞（osteoclast,OC）转分化的调控作用,筛选出相关的关键基因和信号通路,研究骨髓瘤环境下Vγ9Vδ2 T细胞对imDC向OC转分化的调控作用。方法:1、研究Vγ9Vδ2 T细胞对imDC向OC转分化的影响:（1）细胞培养:（1）Vγ9Vδ2 T细胞体外扩增培养:应用唑来膦酸（Zoledronic acid,ZOL）和重组人IL-2（recombinant human interleukin 2,rh IL-2）体外培养外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMNCs）并扩增Vγ9Vδ2 T细胞;（2）imDC细胞体外诱导培养:免疫磁珠分离出的CD14+PBMNCs,在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rh GM-CSF）和重组人白介素-4（recombinant human interleukin 4,rh IL-4）诱导培养下转分化为imDCs;（3）共培养体系建立:采用Transwell分层法建立Vγ9Vδ2 T细胞（上室）-imDC（下室）共培养体系（作为γδT组）,应用重组人巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human macrophage colony-stimulating factor,rh M-CSF）和细胞核因子B受体活化因子配基（recombinant human receptor activator nuclear factorкB ligand,rh RANKL）诱导培养imDC向OC转分化,以imDC在rh M-CSF和rh RANKL诱导培养基中单独培养作为对照组;（2）干预方式:（1）不同细胞比例共培养:Vγ9Vδ2 T和imDC的细胞数比分别以10:1、1:1和1:10共培养;（2）不同干预时间共培养:以imDC开始培养时即与Vγ9Vδ2 T细胞共培养24小时（细胞比例为1:1）为早期共培养（d 0-1γδT）组,培养第3天时再和Vγ9Vδ2 T细胞共培养24小时为d 3-4γδT组、连续共培养为d 0-4γδT组,继续在rh M-CSF和rh RANKL诱导基中培养;（3）破骨细胞数目、功能及相关基因检测:抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色和甲苯胺蓝染色,计数TRAP阳性的OC数目,测量牙本质片的骨吸收陷窝面积。Real-time RT-PCR和Western blot检测CTR和MMP9表达。2、研究imDC与Vγ9Vδ2 T细胞分层共培养后转分化OC的m RNA表达谱改变:以imDC在rh RANKL和rh M-CSF诱导培养基中单独培养为对照组;Vγ9Vδ2 T细胞和imDC以1:1的细胞比分层共培养24小时,为γδT组;两组培养第9天应用Affymetrix m RNA表达谱芯片检测基因表达差异;生物信息学分析基因调节网络及信号通路;Real-time RT-PCR检测Vγ9Vδ2 T细胞抑制imDC向OC转分化过程中关键基因的表达情况。3、研究骨髓瘤环境下Vγ9Vδ2 T细胞对imDC向OC转分化作用:以imDC在rh RANKL和rh M-CSF诱导培养基中单独培养为对照组;RPMI8226细胞培养48小时后,收集培养上清,作为多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）条件培养基（conditioned medium,CM）和rh RANKL和rh M-CSF联合诱导培养imDC,作为MM-CM组;建立Vγ9Vδ2 T细胞（Transwell上室）和MM-CM-imDC（下室）分层共培养体系,作为γδT-MM-CM组。Real-time RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测OC转分化相关基因RANK、Cathepsin K、ATP6V0D2、c-Fos的表达水平。ELISA法检测各组细胞培养上清的CTX-I水平。结果:1、（1）TRAP染色结果示:与对照组比较,γδT组的imDC生成的TRAP染色阳性OC数目显着减少（P<0.05）,Vγ9Vδ2 T细胞与imDC的比例越高,形成的OC越少,组间有显着差异（P<0.05）;imDC向OC转分化的早期阶段与Vγ9Vδ2 T细胞共培养（d 0-1γδT组）生成的OC数目较对照组显着减少（P<0.05）,也较d 3-4γδT组显着减少（P<0.05）,但d 3-4γδT组的TRAP染色阳性的OC数目与对照组比较无明显统计学差异（P>0.05）。（2）预置的牙本质片甲苯胺蓝染色示:γδT组的骨吸收陷窝面积与对照组相比显着减少（P<0.01）,Vγ9Vδ2 T细胞与imDC的比例越高,骨吸收陷窝面积比越小,组间有显着差异（P<0.01）。（3）Real-time RT-PCR和Western blot结果显示:与对照组相比,γδT组（γδT与imDC细胞数比分别为1:1和1:10）CTR和MMP9的m RNA和蛋白表达水平均显着降低（P<0.01）。2、m RNA表达谱芯片结果及生物信息学分析显示与单独培养的imDC比较,与Vγ9Vδ2 T细胞共培养的imDC有显着差异性表达的基因共有293条,其中表达上调的m RNAs有123条,表达下调的m RNAs有170条。GO和KEGG功能富集分析结果发现差异基因与破骨细胞转分化、免疫调节以及细胞因子相互作用等生物学过程相关。显着差异基因中FCGR3A、FCGR3B、BTK、FOSL2、ATP6V0D2、BTUK、CTSK与OC转分化过程相关。Real-time RT-PCR结果显示与对照组相比,γδT组的RANK、Cathepsin K、c-Fos、ATP6V0D2、MMP9、CTR基因水平显着降低（P<0.05）。3、（1）TRAP染色结果示:与对照组相比,MM-CM组的TRAP阳性OC数目显着增加（38.81±3.78 vs 30.52±1.89,P<0.01）;而γδT-MM-CM组的TRAP染色阳性OC较对照组显着减少（10.93±2.08 vs 30.52±1.89,P<0.01）;（2）甲苯胺蓝染色结果示:与对照组相比,MM-CM组牙本质片上的骨吸收陷窝面积显着增加（0.45±0.13 vs 0.31±0.08,P<0.01）,γδT-MM-CM组的骨吸收陷窝面积较对照组显着减少（0.04±0.01 vs 0.31±0.08,P<0.01）;（3）与对照组相比,γδT-MM-CM组的RANK、c-Fos、ATP6V0D2和Cathepsin K的m RNA和蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;（4）γδT-MM-CM组c-Fos的荧光强度较MM-CM组显着下降（P<0.05）;（5）与对照组相比,MM-CM组上清的CTX-1水平显着升高（P<0.01）,而γδT组显着降低（101.24±19.31 vs 326.73±29.67,P<0.01）。结论:1、成功建立Vγ9Vδ2 T细胞和imDC的Transwell分层共培养组体系,ZOL和rh IL-2体外诱导扩增的Vγ9Vδ2 T细胞可抑制imDC向OC转分化及OC的重吸收功能,Vγ9Vδ2 T细胞对OC的抑制作用呈现细胞数量依赖性,而且imDC向OC转分化的早期阶段受Vγ9Vδ2 T细胞的抑制作用更为敏感。2、全基因m RNA表达谱芯片筛选出Vγ9Vδ2 T细胞抑制imDC向OC转分化及重吸收功能的相关基因有BTK、c-Fos、ATP6V0D2、Cathepsin K。3、MM条件培养基可促进imDC向OC转分化,其溶骨作用更强,可以模拟骨髓瘤微环境;Vγ9Vδ2 T细胞在MM环境下可能通过下调RANK、c-Fos、ATP6V0D2、Cathepsin K抑制imDC转分化为OC,并抑制了OC重吸收功能。
黄国宝[2]（2014）在《藻酸盐敷料与hGM-CSF联合治疗难愈皮肤慢性溃疡的研究》文中认为研究背景：难愈皮肤慢性溃疡是指由创（烧）伤、各种感染、长期压迫、糖尿病、血管病变、神经病变和长期放疗等因素所引起的、经历很长时间不愈合的,皮肤、皮下组织甚至合并有肌肉、骨骼等组织的坏死及缺损,常伴有慢性感染发生。一般而言,老年人较青壮年多见,下肢较其他部位多发。随着我国迈入老龄化社会的步伐不断加快,难愈皮肤慢性溃疡的发病率越来越高。一项针对外科各专业住院患者的研究表明,因难愈皮肤慢性溃疡需要住院治疗的患者约占外科住院患者的1.5%-3.0%,而且就目前而言,这一类患者在很多医院中并没有得到集中有效的治疗,而是分散到各个科室中,譬如神经内科、心内科、呼吸科、肿瘤科、放疗科以及外科门诊等,所以统计起来有很大的困难,其实际发病率可能会更高。相当数量的难愈皮肤慢性溃疡患者,是继发于心脑血管疾病、糖尿病、老年病和放射治疗等,其病程漫长,治疗涉及很多方面,这既延误了患者原发病的治疗,又给患者带来了新的痛苦,严重影响了患者的生活质量,同时给患者的家庭带来沉重的经济负担与护理压力,是一个日益严重的社会问题。由于难愈皮肤慢性溃疡病因复杂、类型繁多,无疑给治疗带来了很大的困难。除根据患者的具体情况做一般的病因治疗外,彻底有效的清创和局部用药是非常重要的治疗手段。目前,对皮肤慢性溃疡局部处理的方法很多,如各类药物治疗、生物敷料、转基因治疗等方法,对于难愈皮肤慢性溃疡,一些保护剂、抗生素、维生素、微量元素制剂也已经被广泛应用,但这些药物促进创面愈合的作用还需要进一步的研究,使用方法还需要进一步的改进。激光、光照射等治疗方法对操作要求很高,普及有一定的困难。目前,对于大多数的难愈皮肤慢性溃疡患者,彻底治愈创面的方法仍然是外科手术,不过由于很多该疾病患者合并有比较严重的心脑血管病、糖尿病等内科疾病,手术禁忌症多见,这严重限制了手术的实施。在做好外科清创的基础上,如何选择一种切实有效的促进难愈皮肤慢性溃疡愈合的药物,并辅以适宜创面愈合的外用敷料,从而减轻患者痛苦,缩短病程,一直是人们不断探索的问题。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF,granulocyte-macrophage colony stimulating factor）是复杂的细胞因子网络中的一员,其作用广泛。随着对GM-CSF基础研究和临床研究的不断进展,重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子已经广泛应用于临床治疗的各个领域,如肿瘤放疗、化疗以后,可以作为升高白细胞的药物；骨髓移植后,应用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可以促进其造血功能的恢复；以及可以用于各种原因引起的创伤的治疗、在临床上用于乙型肝炎和抗肿瘤的辅助治疗等。目前,GM-CSF用于各种类型的创面尤其是慢性皮肤溃疡创面的治疗,是近年来人们一直关注的话题。临床应用研究中发现,GM-CSF发挥作用需要一定的时间,而且该药物只有持续的作用于创面,其促进愈合的作用才能发挥到最大限度。同时,外用敷料如果能够在创面上形成一种比较湿润的环境,也有利于创面的更快愈合。藻酸盐敷料是一种新型的功能活性敷料,它可以持续有效地吸收创面的渗液,并在创伤表面形成一层稳定的网状凝胶,这保证了GM-CSF不会很快流失,能够作用更持久。同时,该凝胶能保持创面湿润并使创面同外界环境隔绝,在创面周围形成一个相对密闭的环境,加速肉芽组织及其毛细血管生长,促进创面的各种修复细胞增殖,加速创面的上皮化。藻酸盐敷料不粘于创面,在换药去除敷料时没有明显的疼痛,患者容易接受。目的：根据难愈皮肤慢性溃疡的创面特点,从外用药物促进慢性溃疡自我修复最终达到消灭皮肤缺损的目的出发,将藻酸盐敷料（液超妥）与人粒细胞-巨噬细胞刺激因子（hGM-CSF,金扶宁）联合应用于难愈皮肤慢性溃疡创面,评价其治疗创面和促进愈合的有效性,初步探讨其促进愈合的有关细胞生物学机制,研究两者之间的协同作用,并对患者作出的客观评价进行分析,确定其最佳应用方法。方法：以患者自愿为原则,选择2009年10月-2012年3月在本医院住院治疗的难愈皮肤慢性溃疡患者,主要包括压疮、静脉曲张性溃疡、糖尿病足等,纳入标准：年龄18-60岁,创面经常规清创及抗炎治疗1月以上未能愈合者,创面面积10-100cm2。排除标准：（1）严格控制血糖后空腹血糖仍>10.0mmol/L。（2）严重心功能不全（心功能不全Ⅲ级及以上）、严重肾功能不全（肾功能不全Ⅱ期及以上）、严重消耗性疾病（恶性肿瘤、肺结核、慢性萎缩性胃炎、系统性红斑狼疮）、严重营养不良、外周血管疾病患者,急性感染和急性代谢功能紊乱患者。（3）妊娠或哺乳期患者。（4）依从性达不到试验要求者。所有患者均被详细告知试验内容,签署知情同意书后方可进入试验。共有60例患者符合入选标准,其中男35例,女25例,年龄20-75岁。60例患者中压迫性溃疡（压疮）25例,静脉曲张性溃疡12例,糖尿病足23例。溃疡面积11-85cm2,平均17.2+8.0cm2。病程1-3.5个月,平均.（1.8±2.1）个月。溃疡深度均在皮下软组织层。按照随机分组的原则,将患者分为藻酸盐敷料与hGM-CSF联合治疗组（A组）、hGM-CSF治疗组（B组）、对照组（C组）。3组患者年龄、性别、病情、病程、溃疡面积比较,差异均无统计学意义。所有患者换药时,均去除外层敷料,用生理盐水冲洗清理创面,通过标准化临床路径对患者进行创面清除坏死组织,并用无菌棉球揩干。联合组将人粒细胞-巨噬细胞刺激因子（金扶宁,长春金赛药业有限责任公司,批准文号：国药准字$20080003,规格为100ugrhGM-CSF/10g/支,分子量：14KD）均匀涂于创面,外面以与创面同样大小的液超妥藻酸盐敷料（英国施乐辉公司,批准文号：进2005第2640100号）覆盖创面。hGM-CSF治疗组将金扶宁均匀涂于创面,外面以凡士林油纱覆盖创面。对照组则仅用凡士林纱布覆盖创面。治疗过程中注意无菌操作。3组患者用药前及用药7、14、21d观察创面渗出物、肉芽组织及上皮生长情况及感染等状况的改变,观察有无伤口周围皮肤刺激、过敏等情况的发生；用药7、14、21d计算各组患者的创面愈合面积,计算创面的愈合率；用药前及用药7、14、21d患者行创面疼痛视觉模拟评分法（VAS）评分;用药7、14d患者对治疗效果进行评价；用药前及用药7、14d从患者创面剪取肉芽组织标本,HE染色处理,在光学显微镜下,观察并计算各组创面肉芽组织中的毛细血管及成纤维细胞的数量。数据采用SPSS16.0软件进行分析。结果：1.用药14、21d,3组患者的创面色泽、肉芽组织生长情况做比较,差异有统计学意义,A组创面色泽鲜红,肉芽组织生长良好,优于B组和C组；B组优于C组。2.用药7、14、21d,A组的愈合率分别为9.3+5.5%、23.2士7.7%、56.1士7.5%,B组的愈合率分别为6.5士4.3%、15.3±4.9%、33.7士7.9%,C组的愈合率分别为2.3士4.2%、8.5士6.9%、20.9+8.8%。各个时相点的3组数值之间均做比较,差异有统计学意义。3.用药7d、14、21d,各组患者行创面疼痛视觉模拟评分,各个时相点的3组数值之间均做比较,差异有统计学意义。4.用药7、14d,各组患者对治疗的效果进行评价,各个时相点的3组数值之间均做比较,差异有统计学意义。5.用药7、14d,创面肉芽组织中毛细血管数比较,差异有统计学意义,A组优于B组和C组,B组优于C组。6.用药7、14d,创面肉芽组织中成纤维细胞数比较,差异有统计学意义,A组优于B组和C组,B组优于C组。结论：难愈皮肤慢性溃疡病因复杂、类型繁多,治疗难度大,目前对皮肤溃疡局部处理方法很多,如药物治疗、转基因治疗等方法。对难愈皮肤慢性溃疡治疗的药物和方法的探索,一直是研究的热点。hGM-CSF作为一个既有促创面愈合作用、又可全身应用的细胞因子,局部应用可以有效、安全的治疗如压疮、糖尿病足溃疡、静脉性溃疡等各种难愈皮肤慢性溃疡创面,促进创面愈合。藻酸盐敷料应用于难愈皮肤慢性溃疡创面,使伤口同外界隔绝,形成一个相对密闭的湿润的环境,可以使新生微血管的增生速度加快,同时提高表皮细胞的再生能力并使其移动加快,这对于促进创面愈合有重要意义。另外,藻酸盐敷料在换药时疼痛明显减轻,不易损伤新生组织,易被患者接受。藻酸盐敷料与hGM-CSF联合应用治疗难愈皮肤慢性溃疡,对减少创面渗液量、促进肉芽组织生长、加速再上皮化具有明显协同作用；同时,二者联合应用,可有效减轻创面疼痛,提高患者对治疗的满意度,可作为难愈皮肤慢性溃疡创面的有效的治疗手段之一。藻酸盐敷料与hGM-CSF联合应用治疗难愈皮肤慢性溃疡,可明显促进创面愈合,其机制可能与其促进难愈皮肤慢性溃疡创面毛细血管的生成与成纤维细胞的转化、增殖和迁移有关。
周慧[3]（2013）在《重组灵芝免疫调节蛋白对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症模型治疗及其机制研究》文中提出本文探讨了重组灵芝免疫调节蛋白（Recombinant Ganoderma LucidumImmunoregulatory Protein，rLZ-8）对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症模型治疗及其机制。通过给予不同剂量的环磷酰胺，分别建立单阶段和多阶段环磷酰胺致小鼠白细胞减少症的模型。每日两次腹腔注射rLZ-8治疗白细胞减少症，动物血液分析仪对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞数量进行分析，发现rLZ-8可以显着治疗由环磷酰胺引起的小鼠白细胞减少症，特别是可以增加体内中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞数量。应用WST-1方法检测rLZ-8对小鼠脾脏细胞的作用，结果显示rLZ-8能够增殖小鼠脾脏细胞的刺激，具有潜在的提高机体免疫系统能力和器官造血功能。利用流式细胞仪检测rLZ-8对淋巴细胞分类的作用，包括B细胞、 CD4+CD8+T细胞，结果显示，rLZ-8可以维持CD4+T和CD8+T细胞之间的平衡，这对改善环磷酰胺引起的免疫功能损害和免疫系统失衡将起到至关重要的作用。应用酶联免疫吸附法进行小鼠血清IL-3、IL-4细胞因子的测定，发现rLZ-8可以促进IL-3、IL-4在体内的分泌水平。提取小鼠脾脏细胞RNA，通过RNA标记和阵列杂交，获得基因芯片结果。结合统计学分析、聚类分析、GO分析和Pathway分析，得到rLZ-8在治疗白细胞减少症过程中起到关键作用的基因：Akt2、Txk、Plcb2、Nfkb1、Ppp2c、Map2k1。本实验的创新之处在于：成功建立了两种小鼠白细胞减少症模型，首次证明了rLZ-8可以同时增加各类白细胞数量，具有治疗白细胞减少症的药效学功能。rLZ-8促进免疫细胞增殖作用显着，提升了环磷酰胺诱导的白细胞减少症小鼠的机体免疫能力，对改善环磷酰胺引起的免疫功能损害和免疫系统失衡起到至关重要的作用。在国际上第一次实现了真菌免疫调节蛋白走向临床用药研发的新途径。揭示了rLZ-8治疗白细胞减少症相关的信号转导通路及其分子，为rLZ-8开发为临床用药提供了理论依据。
王鉴[4]（2012）在《蚕蛹粉对rhGM-CSF口服吸收影响的研究》文中认为蛋白药物口服直是世界性难题，本研究拟通过从蚕蛹粉中分离某类蛋白，以其作为载药材料，配制新型重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）口服剂型，为口服蛋白药物的发展打下定的基础。实验中以蚕蛹粉作为载药材料，混合rhGM-CSF药品，口服给药昆明小鼠，灌胃后于15min，40min，60min，120min时间点取血，ELISA结果表明蚕蛹粉与rhGM-CSF混合物的实验组在给药40min后时，血清中rhGM-CSF的浓度最高，并且是只口服rhGM-CSF药品的两倍。为了从蚕蛹粉中寻找帮助rhGM-CSF口服吸收的有效成分，研究中通过匀浆和离心将蚕蛹粉分为可溶组分和不可溶组分，即上清和沉淀两部分。ELISA结果显示给药40min后，上清与rhGM-CSF混合物组的血药浓度是沉淀与rhGM-CSF混合物组的四倍，表明蚕蛹粉有效成分大部分位于上清成分中。利用硫酸铵沉淀法分离上清溶液中的蛋白，沉淀下蛋白用PBS（pH7.6）重新溶解后，利用不同孔径大小（2kDa，10kDa，30kDa和100kDa）的超滤膜截留，分别获得各超滤膜的截留液。各截留液制成冻干粉后，分别作为载药材料混合rhGM-CSF药品口服给药昆明小鼠。ELISA的结果显示，10kDa超滤膜截留液的冻干粉促进rhGM-CSF口服吸收的效果最大，100kDa超滤膜截留液的冻干粉的作用效果次之，30kDa超滤膜截留液的冻干粉几乎没有作用。rhGM-CSF药品与10kDa超滤膜截留液的冻干粉以不同比例混合后口服给药进行药代动力学分析，实验结果表明10kDa超滤膜截留液的冻干粉的作用效果与混合物中10kDa超滤膜截留液的冻干粉的比例相关，混合物中10kDa超滤膜截留液的比例越大血清中rhGM-CSF的浓度越高，两者呈正相关性且血药浓度。各截留液液冻干粉BCA蛋白定量后进行SDS-PAGE和Tricin-SDS-PAGE的分析，结果显示2kDa超滤膜截留液中几乎没有蛋白，10kDa超滤膜截留液中的蛋白主要是10-20kDa蛋白群和少量的30kDa蛋白；30kDa超滤膜截留液中的蛋白80%是30kDa蛋白；100kDa超滤膜截留液中的蛋白主要是30kDa蛋白和80kDa蛋白群。以上实验表明，蚕蛹粉中促进rhGM-CSF口服吸收的有效成分是10-20kDa蛋白。免疫共沉淀分析表明在10kDa超滤膜截留液中未发现rhGM-CSF的相互作用蛋白，说明10-20kDa蛋白不是通过与rhGM-CSF结合成复合物从而促进rhGM-CSF口服吸收。MALDI TOF MS和LTQ MS分析10-20kDa蛋白，结果表明10-20kDa蛋白主要是ubiquitin，chymotrypsin inhibitor，Cationic peptide CP8precursor，Kazal-type proteinase inhibitor，RecName: Full=Chymotrypsin inhibitor SCI-II和RecName: Full=Chymotrypsin inhibitorSCI-I。除ubiquitin外其余的蛋白均为丝氨酸蛋白酶抑制因子，这可能是10-20kDa蛋白能够促进rhGM-CSF口服吸收的原因。
向俾庭,陶站群,张明[5]（2011）在《重组巨噬细胞刺激因子治疗化疗后白细胞减少的疗效分析》文中研究指明目的:探讨重组人粒巨噬细胞集落刺激因子（recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,rhGM-CSF）治疗恶性肿瘤化疗后白细胞及血小板减少的临床疗效。方法:将86例恶性肿瘤化疗患者随机分为两组,治疗组44例化疗结束后24h开始皮下注射重组人粒巨噬细胞刺激因子100μg/d,以3d为1个疗程;对照组42例化疗前1d开始口服鲨肝醇,50mg/次,3次/d,7d为1个疗程,观察两组化疗后的白细胞及血小板减少情况。结果:治疗组白细胞及血小板降少患者明显低于对照组,经统计学处理,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:重组人粒巨噬细胞刺激因子能有效的防治化疗后白细胞及血小板减少症。
崔琳琳[6]（2011）在《转基因家蚕表达药用蛋白的研究》文中认为hIL-28A是2003年美国科学家Kotenko和Sheppard等共同发现的一种新型白细胞介素,可发挥类似Ⅰ型干扰素的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能;人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（human granucyto-macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF）是一种重要的具有免疫调节功能的糖蛋白,在造血调控和免疫调节方面具有重要作用,其临床应用价值很高。为了探讨非转座子载体介导转基因家蚕表达外源基因的可能性,本研究采用精子介导法将构建的重组载体pIZT/V5-His-hIL-28A导入家蚕卵中,通过绿色荧光筛选并结合PCR、DNA杂交等分子鉴定,证实获得了转基因家蚕;Western blotting结果显示转基因家蚕表达重组hIL-28A的分子量为25 kDa,ELISA检测结果显示,hIL-28A在G3代转基因蚕、后部丝腺、脂肪组织冻干粉中的含量分别为0.198、0.320和0.238 ng/g。表明通过非转座子载体介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因的表达。另外,为了研究转基因家蚕的遗传稳定性、所表达蛋白的活性及口服给药后效果,将本研究室先期制作的转hGM-CSF基因蚕（G4代）饲养传代至G12代,取每代转基因家蚕基因组进行PCR扩增,均能扩增出gfp、neo和gm-csf; ELISA检测结果显示,hGM-CSF蛋白在G12代转基因家蚕后部丝腺表达量为20.8 ng/g冻干粉（G3代表达量为5.15 ng/g冻干粉）;将丝腺冻干粉溶解液加入到K562细胞培养液1640中,培养细胞,利用MTT法检测K562细胞数目,结果显示,能促进K562细胞数目的生长;同时将转基因蚕后部丝腺研磨液通过灌胃方式给药,能有效促进白细胞减少模型小鼠白细胞的生长。由此表明,转hGM-CSF基因家蚕具有一定的遗传稳定性,家蚕体内表达的hGM-CSF蛋白具有生物功能,并且可以通过口服方式给药,这为研究利用转基因家蚕表达口服化蛋白药物提供了依据。
郭敏[7]（2011）在《小鼠急性皮肤缺损创面GMCSF表达特点及其作用机制》文中研究说明目的:探讨创面愈合过程中粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）的表达变化及其在创面愈合中的作用和机制。方法:采用小鼠全层皮肤缺损伤模型。局部麻醉后起效后在背部中线近颈侧制作1.0cm×1.0 cm大小全层皮肤缺损伤创面。50只雄性昆明小鼠随机分为2组:对照组（25只）和GM-CSF实验组（25只）,每组分为5个时间点（每个时相点5只）。实验组创面用rhGM-CSF（recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor）凝胶（10μg/cm2）涂抹,对照组创面用凝胶基质涂抹。于伤后第3,5,7,10和14天,观察创面愈合时间;计算创面愈合率;切取创面组织,检测病理组织学变化;通过CD31免疫组化染色结果分析,计算创面微血管密度;应用RT-PCR检测创面GM-CSF、血小板源性生长因子（Platelet-derived growth factor,PDGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）和基质细胞衍生因子-1（Stromal cell derived factor-1,SDF-1）基因表达变化。结果:RT-PCR检测结果显示小鼠致创后创面GM-CSF基因表达伤后3d达峰值（P<0.01）,直到伤后10d均维持较高水平（P<0.05）,伤后14d其表达显着下调接近正常;应用rhGM-CSF凝胶后,创面愈合时间较对照组平均提前（2.4±0.27）d,其创面愈合率于伤后7～14d显着升高（ P<0.05）;组织学显示创伤早期创面中性粒细胞数量较少,创沿上皮细胞增殖数量较多,创面肉芽组织增生明显,并且细胞密度大以梭形细胞和卵圆形细胞为主,新生血管数量较多;创面微血管密度在伤后714d显着增加（P<0.05）;VEGF和SDF-1基因分别于伤后7d和10d内表达显着上调（P< 0.05）,促愈生长因子PDGF基因于致伤后14d内各时相点都明显上调表达（5d,7d,10d,P<0.05;14d,P<0.01）。结论:GM-CSF在创面愈合早期表达增高,GM-CSF可促进创面愈合,其作用机制与PGDF、VEGF、SDF-1基因表达上调有关。
王颖[8]（2010）在《贝氏柯克斯体抗原诱导人树突状细胞活化的研究》文中研究说明贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）为Q热（Q fever）病原体,专性胞内寄生的革兰阴性嗜酸菌。该菌的高致病性和对环境、理化因素的强抵抗力使其成为重要的生物战剂/生物恐怖剂。疫苗接种为预防贝氏柯克斯体感染的有效手段。虽然灭活贝氏柯克斯体全菌Q热疫苗具有良好的免疫保护效果,但是较强的副作用限制了它的推广应用。为研发安全有效的分子Q热疫苗,有必要研究贝氏柯克斯体主要抗原引发的机体免疫应答机制。树突状细胞（dendritic cells, DCs）作为吞噬细胞的一种,是体内专职的抗原提呈细胞（antigen-presenting cells,APCs）,在启动和调节免疫反应中发挥关键的作用。DCs分化成熟过程中具有未成熟（immature dendritic cells,iDCs）与成熟（mature dendritic cells,mDCs）两个阶段,iDCs负责摄取加工处理抗原,当受到抗原刺激时,iDCs迅速分化为mDCs,mDCs呈递摄取的抗原给T细胞,刺激T细胞活化,因而DCs是一种理想的生物免疫佐剂和抗原载体。本研究建立了从人外周血分离单核细胞诱导分化成DCs的培养体系,直接从浓缩白细胞中分离出单核细胞,加入IL-4与GM-CSF诱导后使其分化为人源DCs。以CD83表达量作为衡量DCs成熟度的指标,分析体外诱导培养DCs表面T细胞共刺激分子CD86、CD80、CD40、CD54、CD58、HLA-DR（MHC II）、HLA-ABC（MHC I）的表达。用灭活贝氏柯克斯体I相强毒新桥株和II相弱毒Grita株分别刺激DCs,发现它们诱导人源DCs活化水平差异明显。II相弱毒株刺激DCs各表面分子的表达量是I相强毒株刺激的1～2倍;贝氏柯克斯体强、弱毒株的差别主要是LPS的不同,I相强毒株LPS刺激DCs表面分子表达水平与I相强毒株相似,而去LPS强毒株刺激DCs表面分子表达水平与弱毒株相似,表明贝氏柯克斯体强毒株LPS不能有效激活人源DCs,无法使DCs由未成熟状态转变为完全成熟状态;提示贝氏柯克斯体强毒株的LPS掩盖了菌体外膜蛋白,致使DCs表面受体无法与贝氏柯克斯体表面蛋白相互识别,产生激活信号。贝氏柯克斯体com1、icmO、enhA、secB、lo1A、hspB基因分别编码外膜蛋白Com1、Ⅳ分泌系统蛋白IcmO、增强入侵蛋白EnhA、蛋白输出蛋白SecB、外膜脂质载体蛋白Lo1A以及热休克蛋白HspB,其中Com1蛋白与HspB蛋白在免疫印迹中与贝氏柯克斯体感染血清反应强。6种重组蛋白对人源DCs的激活能力有强有弱:Com1激活DCs能力最强,它所激活DCs的表面分子表达水平最高,甚至强于大肠杆菌LPS;SecB激活DCs能力仅次于Com1,其刺激作用与大肠杆菌LPS不相上下;而HspB激活DCs的能力最弱,除个别表面分子的表达量在其刺激下稍有增加外,大部分表面分子尤其是成熟标志分子CD83的表达量仅为基础表达水平。Com1、SecB、HspB刺激人源DCs的表达的细胞因子也大不相同。Com1激活DCs和SecB激活DCs均表达相对高水平的细胞因子IL-12,而HspB刺激诱导出的不成熟DCs表达相对较高水平细胞因子IL-10。表型成熟度与表达细胞因子的不同表明Com1、SecB、HspB刺激的DCs处于不同活化状态,提示贝氏柯克斯体不同蛋白抗原刺激的DCs可以表现不同的免疫调节能力。为观察处于不同活化状态的DCs对T细胞免疫反应的调节,将Com1、SecB、HspB刺激DCs及其培养上清分别刺激同种同体T细胞。与DCs分子表型相应,HspB刺激DCs和培养上清对T细胞的活化也显示出明显惰性,T细胞表面早期活化标志物CD69的表达仅有限上调,对T细胞的增殖毫无作用,表明HspB不具有启动机体细胞免疫的功能。Com1激活DCs和SecB激活DCs及培养上清均显着提高T细胞表面CD69表达,尤其Com1激活DCs培养上清诱导T细胞CD69表达量达80%以上;CD4+ T细胞与CD8+ T细胞CD69的高表达,证明两种T细胞处于活化状态。Com1激活DCs和SecB激活DCs均诱导T细胞表达I型细胞因子IFN-γ和炎性细胞因子TNF-α,表明T细胞的免疫应答朝向Th1和Tc1分化。另外,T细胞增殖实验揭示了Com1激活DCs和SecB激活DCs均能诱导T细胞高水平增殖,提示Com1和SecB具有诱导机体产生细胞免疫应答能力,为贝氏柯克斯体保护性抗原,可以诱导机体产生细胞免疫应答。
张文平[9]（2010）在《家蚕生物反应器生产的BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床试验及口服吸收机制的研究》文中研究表明人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）是一种酸性糖蛋白,含有127个氨基酸残基,其重组蛋白rhGM-CSF可以在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞中表达,rhGM-CSF分子量从14.4到32kDa不等。rhGM-CSF具有促进骨髓造血前体细胞增殖的作用,刺激粒细胞、单核细胞、巨噬细胞的集落形成和增生。该重组蛋白最初用于骨髓移植、肿瘤化疗及艾滋病相关的中性粒细胞缺乏症。目前,rhGM-CSF是以注射剂的形式应用于临床,有一定的局限性以及剂型引起的不良反应的风险。本实验室利用家蚕杆状病毒表达系统研制了重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（BmrhGM-CSF）口服胶囊,分子量为29kDa,临床前研究表明BmrhGM-CSF在体内外均具有生物学活性：在体外可以促进人骨髓干细胞集落形成；体内试验证明给小鼠、狗和猕猴灌胃BmrhGM-CSF后可以吸收入血并且发挥细胞因子的功能：（1）小鼠口服BmrhGM-CSF后,明显促进脾脏表面造血灶的形成和骨髓DNA的合成；（2）60Co辐照导致造血功能抑制的比格犬口服BmrhGM-CSF后第9天白细胞数目恢复到基值的50%,到第12天恢复到正常水平；（3）经环磷酰胺化疗的猕猴口服BmrhGM-CSF后,相对空白对照组,其白细胞的数量明显增加,其疗效与注射剂rhGM-CSF相似。基于上述工作的基础,本论文开展以下两部分研究：一是BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床试验,二是BmrhGM-CSF胶囊口服吸收机制的研究。一、BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床试验为探索BmrhGM-CSF胶囊单剂量用药安全性,选择健康受试者27例,分成5个剂量组：150μg、300μg、600μg、750μg、900μg,口服给药一次,按照剂量由低到高的顺序安排试验,试验期间需观察前一个剂量组不产生明显的药物不良反应,才进行下一个剂量组试验。经过临床观察以及尿液、血生化、心电图等指标的检查表明：BmrhGM-CSF胶囊单次用药在900μg以下为安全剂量范围,没有发生与药物相关的不良反应。为研究BmrhGM-CSF胶囊药效学,采取两种试验方案,一是选择14例实施化疗的肿瘤患者,分成2个剂量组：150μg和300μg,一天口服2次,连续14天,经过实验室检查发现BmrhGM-CSF胶囊在上述两个剂量下多次给药后没有发生与药物相关的不良反应,而且口服BmrhGM-CSF胶囊后可以预防因化疗导致的白细胞和中性粒细胞下降。另外一种方案是将48例肿瘤放、化疗病人随机分成2组：口服BmrhGM-CSF胶囊组（39人）以及安慰剂对照组（9人）；口服BmrhGM-CSF组于放化疗后第三天口服BmrhGM-CSF:一次300gg,一天2次,连续12天；安慰剂对照组于放化疗后第三天口服安慰剂：一次2粒,一天2次,连续12天。试验发现：在安慰剂组,给药后第3天白细胞和中性粒细胞均开始下降,到第9天白细胞数目下降到最低值为3.31×109/L、中性粒细胞数目为1.53×109/L；而在口服BmrhGM-CSF胶囊组,给药后第9天白细胞数目和中性粒细胞数目分别为4.61×109/L和2.32×109/L。上述结果表明口服BmrhGM-CSF胶囊能够改善肿瘤病人因放化疗引起的白细胞和中性粒细胞下降的症状。根据双处理、双周期、两序列的随机交叉试验设计方法,选择19例志愿者,口服BmrhGM-CSF 8μg/kg或皮下注射大肠杆菌表达的rhGM-CSF 3.75μg/kg,给药后按0h、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h.5.0h、6.0h、8.0h、10.0h、12.0h肱静脉取血,ELISA法测定血液中hGM-CSF浓度,结果表明19人口服BmrhGM-CSF后,有15人血液中检测到与正常血浆有显着差异的血药浓度,用梯形面积法计算药时曲线下面积AUC,根据试验品的AUC与参比品的AUC比值计算相对生物利用度得出BmrhGM-CSF经口服后在15人中有效吸收的平均生物利用度为1%,最高为3.1%。二、BmrhGM-CSF胶囊口服吸收机制的研究BmrhGM-CSF经125I标记后,按10μg/kg、50μg/kg的剂量给ICR小鼠灌胃,给药后在不同的时间收集尿液检测放射活性,结果表明,口服125I-BmrhGM-CSF8h后,经尿液排出大约18%的125I总放射活性。同时在口服125I-BmrhGM-CSF30min后采血,离心析出血清,SDS-PAGE电泳后放射自显影,在高剂量组（50μg/kg）出现一条有125I放射性的条带,大小约18-20 kDa,这条带为125I-BmrhGM-CSF的部分降解产物,低剂量组没有出现125I放射性的条带,说明125I-BmrhGM-CSF可以吸收入血。SD大鼠灌胃50μg/kg、10μg/kg的BmrhGM-CSF,给药后15min在大鼠血清中可检测到GM-CSF。两组大鼠在给药后30min时内血清中GM-CSF浓度达到最高值分别是1010ng/L、212ng/L,然后逐渐下降,一直维持到12h,12h后所有大鼠血浆中均无法测出GM-CSF。说明SD大鼠口服BmrhGM-CSF胶囊后可以被吸收入血。设计自身交叉试验,取3名志愿者口服BmrhGM-CSF或注射rhGM-CSF后0h,1h,2h,3h,4h后的血清样品进行质谱分析（Q-Trap MS/MS TOF）,对各取样点进行EMS扫描,得出各点的一级谱图,以Oh为参照点,其它点分别与之比较,得出差异峰,对差异峰进行EPI扫描,进而得出此差异峰的分子量及其可能的氨基酸序列。以Oh的血清样本的MS数据为对照,在其余不同时间EM峰中找出差异峰,并对这些差异峰作进一步分析。根据分子量建立的肽图谱表明,在差异峰中存在hGM-CSF肽片段,这些大小不同的多肽分子量范围是2039到7336Da,证明通过口服,BmrhGM-CSF可以经肠道吸收进入血液。将蚕蛹冻干粉与大肠杆菌表达的rhGM-CSF混合给小鼠灌胃,结果证明小鼠灌胃这种混合物后其血液中rhGM-CSF浓度升高。将蚕蛹匀浆,离心除去沉淀,将上层溶液置于分液漏斗,分离富脂蛋白层和蛋白质层,制成冻干粉,分别作为载药材料包裹大肠杆菌表达的rhGM-CSF并且给小鼠灌胃。试验结果表明将蚕蛹富脂蛋白层作为载药材料包裹rhGM-CSF给小鼠灌胃后30mmin和60min的血药浓度显着上升,分别为98.73ng/L、106.28ng/L。将蚕蛹蛋白层作为载药材料包裹rhGM-CSF给小鼠灌胃后30min和60min的血药浓度也会上升,分别为48.73ng/L、76.25ng/L,说明蚕蛹富脂蛋白层和蛋白质层均可以促进rhGM-CSF的口服吸收,而且蚕蛹富脂蛋白层作为载药材料包裹rhGM-CSF的效果比蚕蛹蛋白层的要好。将大肠杆菌表达的rhGM-CSF用蚕蛹富脂蛋白层包裹后给小鼠灌胃后取血清,用快速液相色谱（FPLC）的10 RI反相柱进一步纯化血清样品的蛋白质,按峰自动收集,再利用MALDI-TOF MS进行质谱分析,结果发现口服rhGM-CSF的小鼠血清中存在14.5kDa的rhGM-CSF,其质谱图类似于皮下注射大肠杆菌表达的rhGM-CSF的小鼠血清质谱图。另外,用5%戊二醛固定蚕蛹富脂蛋白层承载的rhGM-CSF于铜台上,在扫描电子显微镜下观察到蚕蛹富脂蛋白层包裹的rhGM-CSF样品形成近似球形的微囊结构,这种脂质微囊具有脂溶性,它可能与小肠壁绒膜细胞膜融合,通过胞饮作用将rhGM-CSF微囊球通过生物膜内陷形成细胞吞噬体而进入细胞内,继而将rhGM-CSF从小肠壁外转运到小肠壁内。将蚕蛹蛋白通过Sephadex G-150分离柱的分离纯化,我们收集到36管蛋白样品。应用Biacore X-100分析发现其中有1管蛋白样品能够与大肠杆菌表达的rhGM-CSF结合,说明蚕蛹蛋白中存在与rhGM-CSF结合因子,这些因子可能有助于rhGM-CSF通过口服吸收入血,对于这些因子的结构和组成需进一步分析。本论文不仅为BmrhGM-CSF胶囊的Ⅱ期临床研究提供了前期的实验依据,而且也为开发其他家蚕生物反应器生产的同类多肽和蛋白质药物口服剂型提供了一定的理论基础。
解茹[10]（2010）在《聚乙二醇修饰对蛋白质的脱酰胺与二硫键的影响研究》文中研究说明蛋白质药物因其具有高活性、特异性强和生物功能明确等特点使其应用日益广泛,但蛋白质的不稳定性使其在储存或运输过程中常出现脱酰胺降解、二硫键错配以及聚集形成沉淀等现象,造成蛋白质的活性损失甚至产生一定的副作用,降低了其临床使用效果。本论文以重组人血管内皮抑制素和重组人粒细胞集落刺激因子为模型蛋白,利用液相色谱质谱联用技术结合蛋白质酶解技术研究了蛋白质储存过程中发生的脱酰胺过程及二硫键变化,继而对二者进行PEG修饰,重点考察PEG修饰对蛋白质储存过程中脱酰胺与二硫键的影响。本论文从三个方面对药用蛋白质的储存稳定性开展了研究探索。首先,系统研究了重组人血管内皮抑制素在不同储存条件下天冬酰胺的脱酰胺变化,结果表明该蛋白序列中与Gly相连的Asn127在储存过程发生了脱酰胺反应,实验研究不同条件下Asn127脱酰胺过程的动力学并系统考察了不同pH和温度下脱酰胺过程动力学参数,结果表明在实验选择的条件下脱酰胺过程随pH与温度的升高,反应速率加快。其次,研究了重组人粒细胞集落刺激因子中的二硫键连接方式及其对蛋白质稳定性的影响,蛋白酶解产物中检测出分子间二硫键Cys18-Cys18及错配的二硫键Cys18-Cys37、Cys18-Cys65或Cys37-Cys75。蛋白浓度从0.5 mg/mL增加到1.0 mg/mL、1.52 mg/mL,分子间二硫键Cys18-Cys18的含量在其浓度基础上依次增加15.25%、105.08%,表明分子间二硫键在一定范围内受浓度影响,浓度增加可加剧其形成过程。检测出含分子间二硫键的多肽（MW 15710 Da）,该多肽含量随浓度的增加减少且该过程伴随沉淀产生,证明了蛋白质沉淀过程与分子间二硫键形成密切相关。第三部分主要研究了PEG修饰对蛋白质脱酰胺过程和二硫键的影响。采用mPEG-ALD （20 kDa）对原蛋白进行修饰,利用蛋白质酶解技术结合多级质谱技术研究了修饰前后多肽含量的变化并确定修饰位点；研究了PEG修饰对脱酰胺及二硫键的影响,考察了脱酰胺速率常数,结果表明修饰后pH和温度对脱酰胺速率影响降低,但当温度达到一定条件时,加剧了脱酰胺反应的进行。考察修饰后的二硫键,未发现除Cys18-Cys18外错配的二硫键且该二硫键的含量与其浓度呈正比,较未修饰前识别到多肽Leu36-Arg147且修饰后无明显沉淀产生；结果表明PEG修饰可阻止蛋白质分子间二硫键形成并在一定程度上降低脱酰胺反应速率。
二、应用MALDI-TOF-MS鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用MALDI-TOF-MS鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构（论文提纲范文）
（1）Vγ9Vδ2 T细胞对骨髓瘤环境下未成熟树突状细胞转分化为破骨细胞的调控研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Vγ9Vδ2 T细胞对imDC转分化为OC的实验研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 应用芯片技术研究Vγ9Vδ2 T细胞对imDC转分化为OC的调控机制 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 Vγ9Vδ2 T细胞对骨髓瘤环境下imDC转分化为OC的调控研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 Vγ9Vδ2 T细胞在多发性骨髓瘤及骨髓瘤骨病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）藻酸盐敷料与hGM-CSF联合治疗难愈皮肤慢性溃疡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（3）重组灵芝免疫调节蛋白对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症模型治疗及其机制研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1篇 绪论 |
| 第1章 白细胞减少症的研究进展 |
| 1.1 白细胞的生理 |
| 1.2 白细胞减少症 |
| 第2章 灵芝免疫调节蛋白的研究进展 |
| 2.1 基本特征 |
| 2.2 异源重组表达 |
| 2.3 免疫学活性 |
| 2.4 抗体的制备及应用 |
| 2.5 展望 |
| 第3章 环磷酰胺的研究进展 |
| 3.1 环磷酰胺和 B 细胞 |
| 3.2 环磷酰胺和 DC 细胞 |
| 3.3 环磷酰胺和 TH1 细胞 |
| 3.4 环磷酰胺和 TH17 细胞 |
| 3.5 环磷酰胺和 Treg 细胞 |
| 3.6 总结 |
| 第2篇 研究内容 |
| 第1章 rLZ-8 对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症模型的药效学研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第2章 rLZ-8 对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症模型的免疫学研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 rLZ-8 对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症模型的转录谱研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第3篇 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）蚕蛹粉对rhGM-CSF口服吸收影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 目录 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 蛋白多肽类药物及其应用 |
| 1.2 开发蛋白多肽类口服药物的商业挑战 |
| 1.2.1 限制蛋白多肽类药物口服生物利用度的障碍 |
| 1.3 蛋白多肽类口服药物的研究进展 |
| 1.3.1 化学修饰 |
| 1.4 GM-CSF 药物的市场介绍 |
| 第二章 实验设计方案 |
| 2.1 实验目的和意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 实验设计路线图 |
| 第三章 蚕蛹粉作为载药材料对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 蚕蛹粉作为载药材料对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 3.2.2 ELISA 检测小鼠血清中 rhGM-CSF 的水平 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 蚕蛹粉离心后的上清和沉淀对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 蚕蛹粉中不同组分的分离 |
| 4.2.2 冻干 |
| 4.2.3 上清和沉淀组分对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 4.2.4 ELISA 检测小鼠血清中 rhGM-CSF 的水平 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 上清溶液中蛋白的分离 |
| 5.1 材料，试剂和仪器 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.1.4 试剂配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 蚕蛹粉中可溶性组分的提取 |
| 5.2.2 上清中蛋白的硫酸铵分级沉淀 |
| 5.2.3 超滤 |
| 5.2.4 BCA 法蛋白定量 |
| 5.2.5 各截留液冻干粉的 SDS-PAGE 和 Tricine-SDS-PAGE 分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 蚕蛹粉可溶性组分的硫酸铵分级沉淀结果的 SDS-PAGE 分析 |
| 5.3.2 BCA 法蛋白定量及各截留液的冻干粉的产率 |
| 5.3.3 超滤膜超滤后样品的 SDS-PAGE 和 Tricine-SDS-PAGE 分析 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 各截留液的冻干粉作为载药材料对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 6.1 材料，试剂和实验动物 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 仪器 |
| 6.1.4 实验动物 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 各超滤膜截留液的冻干粉作为载药材料对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 6.2.2 ELISA 检测 2.1 中小鼠血清中 rhGM-CSF 的水平 |
| 6.2.3 不同混合比例的 10 kDa 超滤膜截留液的冻干粉对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 6.2.4 ELISA 检测 2.3 中小鼠血清中 rhGM-CSF 的水平 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 不同超滤膜截留液的冻干粉作为载药材料对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 6.3.2 不同混合比例的 10 kDa 超滤膜截留液的冻干粉对 rhGM-CSF 口服吸收的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 10-20 kDa 蛋白促进 rhGM-CSF 口服吸收机制的研究 |
| 7.1 材料和试剂 |
| 7.1.1 材料，软件和实验仪器 |
| 7.1.2 试剂与仪器 |
| 7.1.3 试剂配制 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 Co-IP 分析 10 kDa 超滤膜截留液的冻干粉是否存在 rhGM-CSF 的相互作用蛋白 |
| 7.2.2 10 kDa 超滤膜截留液冻干粉的 2-D 分析 |
| 7.2.3 10 kDa 超滤膜截留液的冻干粉中蛋白的 Resource Q 阴离子柱交换纯化 |
| 7.2.4 MALDI TOF MS 分析 |
| 7.2.5 LTQ MS分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 免疫共沉淀结果 |
| 7.3.2 双向电泳结果 |
| 7.3.3 Resource Q 柱阴离子交换纯化 10 kDa 超滤膜截留液的冻干粉中蛋白的结果 |
| 7.3.4 MALDI TOF 质谱分析结果 |
| 7.3.5 LTQ MS分析结果 |
| 7.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）转基因家蚕表达药用蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 白细胞介素(IL)-28/IL-29 研究概述 |
| 1 IL-28／29 基因结构及编码蛋白 |
| 2 IL-28/IL-29 来源 |
| 3 IL-28/IL-29 的受体及信号转导 |
| 4 IL-28/IL-29 的生物活性 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子研究进展 |
| 1 hGM-CSF 的概述 |
| 2 hGM-CSF 的表达调控 |
| 3 hGM-CSF 的表达 |
| 4 重组hGM-CSF 的应用 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究报告 |
| 第三章 研究目的与研究内容 |
| 1 研究目的及意义 |
| 2 研究内容 |
| 第四章 实验材料与实验方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 常用仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 参考文献 |
| 第五章 非转座子载体介导的转基因家蚕表达hIL-28A |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 转hGM-CSF 基因家蚕遗传稳定性及其表达蛋白生物活性的研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 总结 |
| 1 已取得的成果 |
| 2 有待研究的内容 |
| 研究生期间发表文章 |
| 项目资助 |
| 附表一：英文简写对照表 |
| 致谢 |
（7）小鼠急性皮肤缺损创面GMCSF表达特点及其作用机制（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 GMCSF 研究现状 |
| 参考文献 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 主要检测指标及方法 |
| 1.4.1 创面愈合时间及创面愈合率 |
| 1.4.2 常规病理检测 |
| 1.4.3 免疫组化染色 |
| 1.4.4 微血管密度（Microvessel density , MVD） |
| 1.4.5 总RNA 的提取及鉴定 |
| 1.4.6 RT-PCR 检测创面愈合相关基因表达变化 |
| 1.4.6.1 PCR 反应体系 |
| 1.4.6.2 PCR 反应条件 |
| 1.4.6.3 凝胶电泳及灰度值的测定 |
| 1.4.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 创面总RNA 鉴定 |
| 2.2 小鼠创面GM-CSF 的表达特点 |
| 2.3 创面愈合时间 |
| 2.4 创面愈合率 |
| 2.5 创面一般病理观察比较 |
| 2.6 微血管密度（MVD） |
| 2.7 创面愈合相关因子基因表达变化 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（8）贝氏柯克斯体抗原诱导人树突状细胞活化的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 人源树突状细胞体外诱导培养体系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 贝氏柯克斯体刺激人源树突状细胞表型分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 贝氏柯克斯体膜蛋白诱导人源树突状细胞活化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 代表性论着 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）家蚕生物反应器生产的BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床试验及口服吸收机制的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写术语表 |
| 第一篇 文献综述及实验设计 |
| 第一章 多肽和蛋白质药物口服给药的研究进展 |
| 1 多肽和蛋白质药物认识过程 |
| 2 多肽和蛋白质药物口服剂型的国内外开发近况 |
| 3 开发蛋白多肽类口服药物的问题与挑战 |
| 3.1 影响多肽和蛋白质药物口服吸收的因素 |
| 3.2 蛋白多肽类口服药物的挑战 |
| 4 促进蛋白多肽类口服药物吸收的策略 |
| 4.1 前药策略 |
| 4.2 化学结构修饰 |
| 4.3 酶抑制剂 |
| 4.4 吸收促进剂 |
| 4.5 纳米粒载体 |
| 4.6 脂质体 |
| 4.7 定位释放 |
| 4.8 微乳 |
| 4.9 基因工程 |
| 5 蛋白多肽类口服药物开发前景与展望 |
| 第二章 家蚕生物反应器生产的蛋白多肽类口服药物研究进展 |
| 1 口服rhGM-CSF |
| 2 口服胰岛素(CTB-INS) |
| 3 口服人乳铁蛋白(hLF) |
| 4 口服人生长激素 |
| 5 口服rhOPG |
| 6 口服rhEPO |
| 7 口服疫苗 |
| 第三章 实验设计 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 研究的主要内容 |
| 2.1 BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床研究 |
| 2.2 BmrhGM-CSF胶囊口服吸收机制的研究 |
| 第二篇 BMRHGM-CSF胶囊Ⅰ期临床研究 |
| 第四章 BMRHGM-CSF胶囊Ⅰ期临床单次剂量给药安全性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物及临床研究基地 |
| 1.2 受试者 |
| 1.3 主要仪器及试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 受试者一般情况 |
| 2.2 用药前后的一般检查结果和分析 |
| 2.3 实验室检查结果和分析 |
| 2.4 不良反应 |
| 3 结论 |
| 第五章 BMRHGM-CSF胶囊Ⅰ期临床生物利用度研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物及临床研究基地 |
| 1.2 受试者 |
| 1.3 主要仪器及试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 受试者体检及参加试验情况 |
| 2.2 血清中rhGM-CSF测定方法的质控结果 |
| 2.3 生物利用度 |
| 2.4 不良反应 |
| 3 结论 |
| 第六章 Ⅰ期临床药效学初步研究(一):肿瘤化疗患者口服BMRHGM-CSF胶囊自身对照试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物及临床研究基地 |
| 1.2 受试者选择 |
| 1.3 主要仪器及试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 受试者一般情况 |
| 2.2 一般检查结果 |
| 2.3 实验室检查结果 |
| 2.4 药物不良反应 |
| 3 结论 |
| 第七章 Ⅰ期临床药效学初步研究(二):肿瘤放化疗患者口服BMRHGM-CSF及安慰剂平行对照试验 |
| 1 材料与分析 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 受试者选择 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论 |
| 第三篇 BMRHGM-CSF胶囊口服吸收机制的研究 |
| 第八章 小鼠口服~(125)I-BMRHGM-CSF后在体内的药代动力学 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂、药物及实验动物 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠口服~(125)I-BmrhGM-CSF后放射性的排泄 |
| 2.2 小鼠口服~(125)I-BmrhGM-CSF后血清SDS-PAGE放射自显影 |
| 3 结论 |
| 第九章 SD大鼠口服BMRHGM-CSF胶囊后体内的血药浓度变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂、药物及实验动物 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论 |
| 第十章 人口服BMRHGM-CSF后血液中HGM-CSF的质谱鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 受试者 |
| 1.3 主要仪器及试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 口服BmrhGM-CSF胶囊后人体血清质谱分析结果 |
| 2.1.1 口服BmrhGM-CSF胶囊后人体血清EMS差异性(与Oh比较)检测结果 |
| 2.1.2 口服BmrhGM-CSF胶囊后人体血清EPI分析结果 |
| 2.1.3 口服BmrhGM-CSF胶囊后人体血清的hGM-CSF肽指纹分子量对照分析 |
| 2.2 皮下注射rhGM-CSF后人体血清质谱分析结果 |
| 2.2.1 皮下注射rhGM-CSF后人体血清EMS差异性(与Oh比较)检测结果 |
| 2.2.2 皮下注射rhGM-CSF后人体血清EPI分析结果 |
| 2.2.3 皮下注射rhGM-CSF后人体血清的hGM-CSF肽指纹分子量对照分析 |
| 3 结论 |
| 第十一章 蚕蛹中不同组份作为载药材料对RHGM-CSF口服吸收的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂、药物及实验动物 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 蚕蛹不同组份的制备 |
| 1.2.2 蚕蛹冻干粉协同rhGM-CSF口服吸收的小鼠试验 |
| 1.2.3 蚕蛹富脂蛋白层组份协同rhGM-CSF口服吸收的小鼠试验 |
| 1.2.4 蚕蛹蛋白层组份协同rhGM-CSF口服吸收的小鼠试验 |
| 1.2.5 ELISA检测小鼠血清中rhGM-CSF浓度 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 蚕蛹冻干粉协同rhGM-CSF口服吸收的小鼠试验结果 |
| 2.2 蚕蛹富脂蛋白层组份协同rhGM-CSF口服吸收的小鼠试验结果 |
| 2.3 蚕蛹蛋白层组份协同rhGM-CSF口服吸收的小鼠试验结果 |
| 3 结论 |
| 第十二章 蚕蛹富脂蛋白层作为载药材料对RHGM-CSF口服吸收后血清样品的质谱分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物、药品试剂及仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 MALDI-TOF MS质谱分析rhGM-CSF皮下注射和口服吸收的血清样品 |
| 1.2.2 FPLC联合MALDI-TOF MS分析rhGM-CSF皮下注射和口服吸收的血清样品 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 rhGM-CSF皮下注射和口服吸收的血清MALDI-TOF MS质谱分析结果 |
| 2.2 FPLC联合MALDI-TOF MS质谱分析rhGM-CSF皮下注射和口服吸收的血清样品结果 |
| 2.2.1 FPLC分离纯化蛋白 |
| 2.2.2 MALDI-TOF MS质谱分析经过FPLC分离纯化的各组样品 |
| 3 结论 |
| 第十三章 蚕蛹富脂蛋白层作为载药材料包裹蛋白质药物的微观研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂、药物、仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 扫描电镜观察结果 |
| 3 结论 |
| 第十四章 蚕蛹中RHGM-CSF口服吸收协同因子分析 |
| 1 材料与分析 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 试验分组 |
| 1.2.2 试验流程 |
| 1.2.3 Biacore X-100对hGM-CSF蛋白结合动力学分析步骤 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 rhGM-CSF标准品偶联效果 |
| 2.2 rhGM-CSF抗体与rhGM-CSF抗原结合反应 |
| 2.3 筛选与rhGM-CSF结合反应的蛋白样品 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 在学期间发表论文 |
（10）聚乙二醇修饰对蛋白质的脱酰胺与二硫键的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质药物概况 |
| 1.1.1 蛋白质药物的种类 |
| 1.1.2 蛋白质药物的研发趋势及分布 |
| 1.1.3 蛋白质药物存在的问题及解决办法 |
| 1.1.4 聚乙二醇修饰蛋白技术 |
| 1.1.4.1 聚乙二醇的理化特性 |
| 1.1.4.2 聚乙二醇修饰方法 |
| 1.1.4.3 聚乙二醇修饰蛋白药物国内外研发现状 |
| 1.2 蛋白质结构及其研究方法 |
| 1.2.1 蛋白质基本结构 |
| 1.2.2 蛋白质结构研究常用方法 |
| 1.2.2.1 X-ray衍射 |
| 1.2.2.2 核磁共振 |
| 1.2.2.3 圆二色光谱 |
| 1.3 蛋白质储存稳定性研究进展 |
| 1.3.1 物理不稳定性 |
| 1.3.2 化学不稳定性 |
| 1.3.2.1 脱酰胺反应 |
| 1.3.2.2 氧化作用 |
| 1.3.2.3 还原作用 |
| 1.3.2.4 水解作用 |
| 1.3.2.5 其他化学降解 |
| 1.4 蛋白质储存稳定性研究方法 |
| 1.4.1 电泳法 |
| 1.4.2 高效毛细管电泳法 |
| 1.4.3 高效液相色谱法 |
| 1.4.3.1 反相色谱 |
| 1.4.3.2 凝胶过滤色谱 |
| 1.5 生物质谱技术及其在蛋白质研究中的应用 |
| 1.5.1 生物质谱技术 |
| 1.5.1.1 电喷雾质谱技术 |
| 1.5.1.2 基质辅助激光解吸附质谱技术 |
| 1.5.2 生物质谱在蛋白质研究中的应用 |
| 1.5.2.1 蛋白质和多肽的分子量测定 |
| 1.5.2.2 蛋白质和多肽的序列分析 |
| 1.5.2.3 蛋白质识别 |
| 1.5.2.4 质谱在蛋白质脱酰胺研究中的应用 |
| 1.5.2.5 质谱在蛋白质二硫键研究中的应用 |
| 1.5.2.6 质谱在蛋白质其它翻译后修饰分析中的应用 |
| 1.5.2.7 质谱在生物大分子相互作用研究中的应用 |
| 1.6 本论文的研究内容 |
| 第二章 重组人血管内皮抑制素脱酰胺研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 脱酰胺 |
| 2.1.2 重组人血管内皮抑制素 |
| 2.2 质谱分析重组人血管内皮抑制素的脱酰胺 |
| 2.2.1 材料与仪器 |
| 2.2.1.1 材料与试剂 |
| 2.2.1.2 仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 rhEndostatin样品处理 |
| 2.2.2.2 高效液相色谱质谱(HPLC-MS)分析 |
| 2.2.2.3 飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析 |
| 2.2.2.4 数据处理 |
| 2.2.3 结果与讨论 |
| 2.2.3.1 质谱法识别脱酰胺位点 |
| 2.2.3.2 pH对脱酰胺过程的影响 |
| 2.2.3.3 温度对脱酰胺过程的影响 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 重组人粒细胞集落刺激因子二硫键研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 二硫键 |
| 3.1.2 重组人粒细胞集落刺激因子 |
| 3.2 质谱分析重组人粒细胞集落刺激因子的二硫键 |
| 3.2.1 材料与仪器 |
| 3.2.1.1 材料与试剂 |
| 3.2.1.2 仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 rhG-CSF样品处理 |
| 3.2.2.2 高效液相色谱质谱(HPLC-MS)分析 |
| 3.2.2.3 基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析 |
| 3.2.2.4 数据处理 |
| 3.2.3 结果与讨论 |
| 3.2.3.1 质谱法结合胰蛋白酶酶解识别分子间二硫键 |
| 3.2.3.2 质谱法结合胰凝乳蛋白酶酶解识别分子内二硫键 |
| 3.2.3.3 溶液浓度对分子间二硫键的影响 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 PEG修饰蛋白脱酰胺及二硫键研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 PEG定点修饰rhEndostatin与rhG-CSF |
| 4.2.1 材料与仪器 |
| 4.2.1.1 材料与试剂 |
| 4.2.1.2 仪器 |
| 4.2.2 PEG修饰重组人血管内皮抑制素 |
| 4.2.2.1 PEG修饰过程 |
| 4.2.2.2 PEG修饰产物的分离纯化 |
| 4.2.2.3 MALDI-TOF MS分析PEG修饰产物 |
| 4.2.3 PEG修饰重组人粒细胞集落刺激因子 |
| 4.2.3.1 PEG修饰过程 |
| 4.2.3.2 PEG修饰产物的分离纯化 |
| 4.2.3.3 MALDI-TOF MS分析PEG修饰产物 |
| 4.3 质谱法鉴别PEG修饰位点 |
| 4.3.1 材料与仪器 |
| 4.3.1.1 材料与试剂 |
| 4.3.1.2 仪器 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.2.1 样品处理 |
| 4.3.2.2 高效液相色谱质谱(HPLC-MS)分析条件 |
| 4.3.3 结果与讨论 |
| 4.3.3.1 rhEndostatin的PEG修饰位点 |
| 4.3.3.2 rhG-CSF的PEG修饰位点 |
| 4.4 质谱法分析PEG修饰rhEndostatin的脱酰胺 |
| 4.4.1 材料与仪器 |
| 4.4.2 试验方法 |
| 4.4.3 结果与讨论 |
| 4.4.3.1 质谱法识别PEG修饰后脱酰胺位点 |
| 4.4.3.2 pH对脱酰胺过程的影响 |
| 4.4.3.3 温度对脱酰胺过程的影响 |
| 4.5 质谱法分析PEG修饰rhG-CSF的二硫键 |
| 4.5.1 材料与仪器 |
| 4.5.2 试验方法 |
| 4.5.3 结果与讨论 |
| 4.5.3.1 质谱法识别分子内及分子间二硫键 |
| 4.5.3.2 溶液浓度对分子间二硫键的影响 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 后续研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者及导师简介 |
四、应用MALDI-TOF-MS鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构（论文参考文献）
- [1]Vγ9Vδ2 T细胞对骨髓瘤环境下未成熟树突状细胞转分化为破骨细胞的调控研究[D]. 朱晓琳. 福建医科大学, 2016(04)
- [2]藻酸盐敷料与hGM-CSF联合治疗难愈皮肤慢性溃疡的研究[D]. 黄国宝. 山东大学, 2014(12)
- [3]重组灵芝免疫调节蛋白对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症模型治疗及其机制研究[D]. 周慧. 吉林大学, 2013(08)
- [4]蚕蛹粉对rhGM-CSF口服吸收影响的研究[D]. 王鉴. 浙江理工大学, 2012(01)
- [5]重组巨噬细胞刺激因子治疗化疗后白细胞减少的疗效分析[J]. 向俾庭,陶站群,张明. 中国当代医药, 2011(20)
- [6]转基因家蚕表达药用蛋白的研究[D]. 崔琳琳. 苏州大学, 2011(06)
- [7]小鼠急性皮肤缺损创面GMCSF表达特点及其作用机制[D]. 郭敏. 重庆医科大学, 2011(11)
- [8]贝氏柯克斯体抗原诱导人树突状细胞活化的研究[D]. 王颖. 中国人民解放军军事医学科学院, 2010(01)
- [9]家蚕生物反应器生产的BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床试验及口服吸收机制的研究[D]. 张文平. 浙江大学, 2010(08)
- [10]聚乙二醇修饰对蛋白质的脱酰胺与二硫键的影响研究[D]. 解茹. 北京化工大学, 2010(01)