一、不同重力环境对流体剪切应力诱导成骨细胞环氧合酶-2蛋白表达的影响（论文文献综述）
李晓辰[1]（2021）在《TRPM7介导膝骨关节炎中滑膜巨噬细胞M1型极化的机制研究及膝痹宁方的干预作用》文中进行了进一步梳理目的:探究瞬时电位受体通道（Transient receptor potential melastatin 7,TRPM7）介导膝骨关节炎（Knee osteoarthritis,KOA）滑膜巨噬细胞M1型极化的分子机制以及膝痹宁方的干预效应。方法:1)体内实验采用内侧半月板失稳（destabilization of the medial meniscus,DMM）方法使C57BL/6小鼠膝关节失稳,ELISA检测血清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平,通过HE染色评估滑膜炎症并行Krenn评分,通过番红O固绿染色评估软骨退变并行OARSI评分,采用免疫荧光双重染色技术标记F4/80与iNOS或CD206等巨噬细胞特异性标记物,以评估机械应力失常的KOA模型中滑膜巨噬细胞的极化方向。2)体外实验采用细胞应力加载系统,给与巨噬细胞5HZ的0%、7%、12%幅度的循环机械牵张力,Western Blot和PCR检测M1型巨噬细胞极化标记物iNOS、IL-1β及M2型巨噬细胞极化标记物CD206、Arg-1蛋白和基因的表达;应用TRPM7的选择性抑制剂NS8593,给与巨噬细胞5HZ的12%的循环机械牵张力,Western Blot和PCR检测iNOS、IL-1β、CD206、Arg-1蛋白和基因的表达。3)应用TRPM7的小干扰RNA,验证小干扰RNA效率,Western Blot检测TRPM7、ERK1/2及其磷酸化、P65及其磷酸化和IκBα等表达变化。4)应用TRPM7选择性抑制剂,通过HE染色、天狼星红染色和番红O固绿染色分别观察KOA小鼠滑膜炎症、纤维化及软骨退变并分别行滑膜Krenn和软骨OARSI评分,采用免疫荧光双重染色技术标记F4/80与iNOS或CD206等巨噬细胞特异性标记物,ELISA检测血清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平,Western Blot检测滑膜组织中TRPM7、ERK1/2及其磷酸化、P65及其磷酸化和IκBα等蛋白表达变化,Western Blot和PCR检测软骨组织基质降解相关蛋白和基因表达变化。5)DMM方法建立KOA小鼠模型,TRPM7抑制剂组为阳性对照组,膝痹宁组为观察组,通过HE染色、天狼星红染色和番红O固绿染色分别观察KOA小鼠滑膜炎症、纤维化及软骨退变并分别行滑膜Krenn和软骨OARSI评分,ELISA检测血清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平,Western Blot和PCR检测软骨组织基质降解相关蛋白和基因表达变化。6)DMM方法建立KOA小鼠模型,采用免疫荧光双重染色技术标记F4/80与iNOS或CD206等巨噬细胞特异性标记物,观察KOA模型中滑膜巨噬细胞的极化表型,Western Blot检测滑膜组织中TRPM7、ERK1/2及其磷酸化、P65及其磷酸化和IKBα等的蛋白表达。结果:1)DMM方法建立的KOA小鼠模型中,表现出滑膜炎症和软骨退变,血清IL-1β、TNF-α表达增高,滑膜巨噬细胞浸润增多,iNOS阳性细胞比率显着上调（P<0.05）。2)7%的循环机械牵张力干预巨噬细胞后,与0%组相比,CD206和Arg-1蛋白表达上调,iNOS、IL-1β蛋白表达下调（P<0.05）;而12%组iNOS、IL-1β蛋白相比于0%组表达显着上调,CD206和Arg-1蛋白表达下调（P<0.05）;应用TRPM7抑制剂后,12%循环牵张力造成的iNOS、IL-1β上调趋势下降,而CD206和Arg-1下调趋势回调（P<0.05）。3)12%的机械牵张力可以增强TRPM7的蛋白表达,ERK和P65的磷酸化增多,使IκBα表达下调（P<0.05）,在应用TRPM7的siRNA后,ERK和P65磷酸化减少,IκBα表达回调（P<0.05）。4)对比假手术组小鼠,KOA小鼠滑膜和软骨病理评分显着增高,滑膜组织中的TRPM7、ERK和P65磷酸化明显增多（P<0.05）;而在给与小鼠选择性抑制剂后,病理评分显着下降,软骨中MMP-3和MMP-13蛋白和基因及Adamts-4和-5基因表达显着下调,滑膜中TRPM7、磷酸化的ERK和P65也显着下调（P<0.05）。5)对比模型组小鼠,膝痹宁组小鼠血清IL-1β、TNF-α显着下调,滑膜和软骨病理评分减少,软骨中MMP-3和MMP-13蛋白和基因及Adamts-4和-5基因表达显着下调（P<0.05）。6)对比模型组小鼠,膝痹宁方显着降低小鼠滑膜组织中M1型巨噬细胞比率,同时也能降低滑膜组织中TRPM7、磷酸化ERK1/2、磷酸化P65等的蛋白表达,同时上调IκBα表达（P<0.05）。结论:1)DMM方法诱导的KOA模型中存在巨噬细胞极化,异常机械应力可以刺激滑膜巨噬细胞极化。2)循环机械牵张力通过激活TRPM7-ERK及NF-κB信号通路诱导巨噬细胞极化。3)膝痹宁方有效改善KOA小鼠滑膜炎症、滑膜纤维化和软骨退变。4)膝痹宁方的治疗效应是通过抑制TRPM7-ERK及NF-κB信号通路的活化,从而抑制滑膜巨噬细胞M1型极化实现的。
何良志[2]（2021）在《流体剪切力介导Piezo1机械敏感性离子通道对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响》文中研究说明目的:伴随人口老龄化加剧,骨质疏松症逐渐成为社会的重大负担,已演变为严重的公共卫生事件。然而,骨质疏松症的发生、发展机制目前仍不明确,流体力学在骨质疏松症的研究中起着重要作用,不容忽视。最近研究发现的Piezo1机械敏感性离子通道或许在骨质疏松症的发生、发展过程中起相关作用,仍未可知。课题组前期研究发现敲除成骨细胞内Piezo1可以抑制MC3T3-E1成骨细胞的迁移,本研究探索流体剪切力是否通过Piezo1离子通道对MC3T3-E1成骨细胞增殖产生作用,以及ERK5、ERK1/2通路、细胞骨架在其中发挥的作用。方法:使用本课题组自行研究设计的流体剪切力加载装置,对MC3T3-E1成骨细胞加载不同模式（循环模式和间停模式）及强度（3、6、9、12、15、18dyne/cm2）的流体剪切力,使用免疫荧光染色及Western Blot方法观察促进Piezo1蛋白表达最佳流体剪切力条件。过表达（Yoda1）和抑制（Gs MTx4）成骨细胞内Piezo1蛋白表达,使用Western Blot方法及Ed U染色观察成骨细胞增殖及ERK5、ERK1/2通路磷酸化变化,加载流体剪切力并过表达和抑制Piezo1蛋白,使用Western Blot及Ed U染色观察成骨细胞增殖及ERK5、ERK1/2通路变化。鬼笔环肽染色和免疫荧光染色观察成骨细胞加载流体剪切力及抑制Piezo1表达（Gs MTx4）后细胞骨架和细胞骨架蛋白变化,进一步使用Ed U染色观察加载流体剪切力及抑制骨架蛋白（Cyto D）后对成骨细胞增殖的变化。结果:对成骨细胞加载45min循环模式及间停模式流体剪切力,发现与空白组相比,循环模式各组成骨细胞内Piezo1蛋白表达更高,在不同强度循环流体剪切力下,6dyne/cm2时成骨细胞内Piezo1蛋白表达量最高（p<0.001）。过表达Piezo1促进成骨细胞内增殖相关蛋白PCNA（p<0.01）、MCM2（p<0.01）、Cyclin D1（p<0.001）表达,成骨细胞增殖率亦明显增加（p<0.001）,同时促进ERK5（p<0.01）、ERK1/2（p<0.001）磷酸化,抑制Piezo1表达则抑制成骨细胞内PCNA（p<0.01）、MCM2（p<0.05）、Cyclin D1（p<0.001）表达,细胞增殖率明显降低（p<0.05）,ERK5（p<0.05）、ERK1/2（p<0.05）磷酸化也明显降低。流体剪切力（6dyne/cm2、循环模式45min）则促进成骨细胞内PCNA（p<0.05）、MCM2（p<0.001）、Cyclin D1（p<0.001）表达,细胞内ERK5（p<0.001）、ERK1/2（p<0.001）磷酸化也明显上调。与单纯FSS相比,FSS+Yoda1进一步促进成骨细胞内Piezo1蛋白表达（p<0.05）,PCNA（p<0.05）、Cyclin D1（p<0.001）表达明显上调,而MCM2表达无明显增加,Ed U染色进一步证明FSS+Yoda1组较FSS组细胞增殖率更高,ERK5（p<0.001）、ERK1/2（p<0.05）磷酸化作用增强。FSS+Gs MTx4组较单纯FSS组相比,下调了Piezo1表达（p<0.001）,明显降低了PCNA（p<0.01）、Cyclin D1（p<0.001）表达,减弱了ERK5（p<0.01）、ERK1/2（p<0.001）的磷酸化作用。流体剪切力促进成骨细胞细胞骨架重排（p<0.001）并促进骨架蛋白β-Tubulin、Vimentin高表达,而抑制Piezo1则抑制细胞骨架重排（p<0.001）和骨架蛋白β-Tubulin、Vimentin表达。阻断细胞骨架重排后,成骨细胞增殖率明显降低（p<0.001）。结论:（1）对成骨细胞加载6dyne/cm2循环流体剪切力45min后,细胞内Piezo1蛋白表达最高;（2）流体剪切力介导Piezo1通过ERK5、ERK1/2通路影响成骨细胞增殖;（3）流体剪切力通过细胞骨架影响成骨细胞增殖。
贾梦莹[3]（2021）在《NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用》文中指出目的:颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular Joint Osteoarthritis,TMJOA）是影响口颌功能的颌面部高发病,髁突软骨缺损难以自愈,其退变分子机制不明。力学刺激直接作用软骨,炎症反应广泛参与髁突软骨破坏。细胞焦亡以释放炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β）,IL-18为主要特征,参与慢性炎症,而细胞焦亡在TMJOA软骨细胞中的研究甚少。为此本研究旨在探索异常力学刺激下NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在软骨细胞的表达情况,为TMJOA的靶向治疗提供线索。方法:第一部分:（1）临床研究,收集就诊于新疆医科大学第一附属医院颞下颌关节紊乱病患者颞下颌关节滑液,根据CBCT或MRI检查分为伴髁突骨质破坏的TMJOA患者组与不伴髁突骨质破坏的颞下颌关节结构紊乱病（Temporomandibular Joint internal derangement,TMJID）组,分析临床基线资料。（2）酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析焦亡相关炎性介质IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3在两组的表达差异。第二部分:（1）组织水平,通过SD大鼠单侧前牙反牙合（Unilateral anterior crossbite,UAC）干预4周,8周,12周,建立TMJOA模型,通过体式显微镜观察软骨形态结构,Micro-CT扫描软骨下骨,Mimics 20.0系统分析骨体积分数BV/TV,骨表面积与骨体积比BS/TV,骨小梁厚度Tb.Th及骨小梁个数Tb.N,评价软骨下骨改建情况,组织病理学检查及评分系统评价软骨病损特征。（2）使用免疫组织化学技术检测焦亡经典途径关键分子IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD在正常组与UAC诱导组颞下颌关节组织的表达及分布,实时聚合酶链式反应（Real time polymerase chain reaction,RT-PCR）以及蛋白印迹法（Western blot,WB）检测焦亡关键基因及蛋白在UAC诱导组与对照组的表达情况。第三部分:（1）分子水平,分离培养SD大鼠软骨细胞,分别采用0 dyn/cm2,4 dyn/cm2,12dyn/cm2,16 dyn/cm2的流体剪切力（Fluid Flow Shear Stress,FFSS）干预软骨细胞1h;采用12 dyn/cm2的FFSS干预软骨细胞1h,2h,4h,通过ELISA技术比较软骨细胞培养基上清液中IL-18,IL-1β的表达差异。（2）通过AO-EB染色比较细胞破膜死亡在各组的表达情况。（3）通过WB技术比较焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD在各组的表达差异。结果:第一部分:（1）伴髁突骨质破坏的TMJOA患者与不伴有髁突骨质破坏的TMJID患者好于发中青年女性,均有颞下颌关节疼痛及功能紊乱症状,TMJOA组功能紊乱人数占比较大。（2）颞下颌关节滑液焦亡相关炎性介质IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3的表达比较分析,证明了伴髁突骨质破坏的TMJOA患者IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3的浓度较高（P<0.05）。第二部分:（1）UAC可诱导TMJOA样表现,体式显微镜可见软骨形变,随UAC作用时间延长,较同时间正常对照组病损加重,Micro-CT显示BV/TV较同时间正常对照组降低,软骨下骨丧失明显,UAC诱导4周出现BS/BV增高（P<0.05）,短期骨改建,UAC诱导8周及12周,差异无统计学意义（P<0.05）,Tb.Th在UAC诱导12周减小,Tb.N在UAC诱导4周,8周减小（P<0.05）。UAC诱导组较同时间正常对照组组织病理学评分增加。（2）免疫组化显示UAC组焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD高表达于软骨层,RT-PCR及WB亦检测到UAC诱导组较同时间正常对照组表达高水平的焦亡相关基因及蛋白（P<0.05）。第三部分:（1）ELISA结果表明软骨均接受1h FFSS干预时,4 dyn/cm2,12 dyn/cm2,16 dyn/cm2FFSS干预组较0 dyn/cm2FFSS对照组比较,培养基上清炎性因子IL-1β,IL-18的表达水平增高（P<0.05）。在12dyn/cm2FFSS作用下,随FFSS干预时间延长,软骨细胞焦亡关键分子表达增高（P<0.05）。（2）AO-EB染色表明随FFSS载荷的增加以及作用时间的延长,破膜死亡细胞数增多。（3）WB显示软骨细胞焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD的表达也随FFSS载荷增加以及作用时间的延长而上调（P<0.05）。结论:（1）TMJOA患者滑液中可表达高浓度的焦亡相关炎性介质。（2）单侧前牙反牙合可诱导TMJOA病损,焦亡关键蛋白可表达于髁突软骨层,随OA病损程度加重,焦亡关键分子基因及蛋白的表达量增加。（3）软骨细胞存在细胞焦亡,随FFSS作用软骨细胞强度及时间的增加,软骨细胞焦亡现象加重。
刘波,陈祥和,杨康,余慧琳,陆鹏程[4]（2021）在《DNA甲基化在运动干预骨质疏松中的作用机制》文中研究指明背景:成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡是维持机体骨组织稳定的基础,当两者代谢平衡紊乱时造成骨质流失和骨微细结构退化,导致骨质疏松发生。目的:综述DNA甲基化在骨质疏松中的作用,探讨运动影响DNA甲基化及DNA甲基化调控骨代谢的机制。方法:检索2002年1月至2020年4月CNKI和PubMed等外文生物医学、生物学、体育学期刊系统相关文献,中文关键词:DNA甲基化;骨质疏松;运动干预;机械应力;成骨分化;英文关键词:DNA methylation; Osteoporosis; Exercise intervention; Mechanical stress; Osteogenic differentiation。排除不符合纳入标准的文献,对入选的52条文献进行归纳总结。结果与结论:①DNA甲基化是一种相对保守、稳定的表观修饰,其调控基因表达、沉默以及疾病发生;②研究表明,β-catenin、Runx2、骨桥蛋白等基因甲基化水平降低能促进其表达进而活化Wnt通路;而硬化蛋白、核因子κB受体活化因子配体等基因甲基化水平降低则会促进其表达,抑制Wnt通路以及降低OPG/RANKL比例,进而对成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化及功能产生影响,从而调节骨形成和骨吸收动态平衡;③成骨细胞和破骨细胞为力学刺激敏感细胞,骨骼能将运动产生的机械负荷转变为生物学刺激作用于相关骨细胞分化及功能的发挥,进而调节骨代谢;④体外实验表明,不同形式的机械应力刺激可以改变骨桥蛋白、GNAS1等基因甲基化水平进而调节其表达,从而对骨形成产生积极作用;⑤骨组织是力学敏感组织,而DNA甲基化能通过调节多种因子来调节骨代谢。
张凯淇[5]（2020）在《麝香乌龙丸对CIA小鼠滑膜S1P代谢情况评价》文中进行了进一步梳理目的1通过建立胶原诱导性关节炎（Collagen Induced Arthritis,CIA）小鼠模型,检测CIA小鼠膝关节滑膜液的炎症指标,小鼠膝关节滑膜1-醇激酶（sphingosine kinases,SphK1）、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）和S1P裂解酶（phingosine-1-phosphate lymphoid,S1PL）表达的影响,来评价麝香乌龙丸对CIA小鼠的疗效机制,为麝香乌龙丸在临床上治疗类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）提供实验及理论依据。方法1.在45只DBA/1J小鼠中随机抓取30只作为造模组,剩下的15只则为对照组。造模过程分为首次免疫反应和在在第21天的二次免疫反应。2.制造模型在造模组的小鼠鼠尾的尾根皮下注入为0.1mlCII乳剂,该乳剂是由弗氏完全佐剂和牛II型胶原乙酸溶液等量相互融合制成的。制造CIA模型,当呈现出继发性关节炎症状的小鼠时,则是制造病态模型成功。3.分组从成功造模的小鼠里面中随机挑选15只作为治疗组进行给药治疗,15只作为模型组处理。给药治疗组于第22天开始,进行麝香乌龙丸悬浊溶液灌胃处理,对照组和模型组则是相同体积的生理盐水灌胃。连续灌胃处理21天,于第43天取滑膜液和滑膜。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（Elisa）测量小鼠滑膜液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、1-酸鞘胺醇（S1P）、干扰素-γ（IFN-γ）和血清中S1P浓度,以评估小鼠炎症水平。4.蛋白免疫印迹试验（Western Blot）和免疫组织化学染色测定小鼠膝关节滑膜组织SphK1、S1P和S1PL三种细胞蛋白的表达水平。结果1.与对照组进行相比,CIA模型组小鼠滑膜液中TNF-α、IL-6、IFN-γ和S1P的浓度明显升高,而血清中的S1P浓度下降,差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组小鼠滑膜液中TNF-α、IL-6、IFN-γ和S1P的浓度与CIA模型组相比显着降低,而血清中的S1P浓度升高,差异有统计学意义（P<0.05）;2.Western Blot结果显示,CIA模型组滑膜组织SphK1、S1P和S1PL蛋白相对表达量明显高于对照组,差异有显着意义（P<0.05）;经麝香乌龙丸治疗后,CIA小鼠滑膜组织SphK1、S1P和S1PL蛋白表达明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）;3.免疫组化结果显示,CIA模型组滑膜组织S1P、SphK1和SS1PL的阳性表达和平均光密度值显着多于对照组（P<0.05）;经麝香乌龙丸治疗后,CIA小鼠膝关节滑膜组织中的SphK1、S1P和S1PL的阳性表达和平均光密度值显着减少（P<0.05）。结论1麝香乌龙丸有效降低CIA小鼠的关节滑膜液中炎症因子含量。2麝香乌龙丸能够抑制膝关节滑膜S1PL、SphK1和S1P的蛋白表达。图5幅;表1个;参187篇。
贺祖斌[6]（2020）在《改良脊柱矫正系统的有限元分析研究》文中研究表明目的:建立正常成年男性L1-L3脊柱三维有限元模型,模拟后路椎弓根钉固定及改良脊柱矫正系统固定手术,并分析三种模型比较其生物力学特征。方法:采集1例正常成年男性腰椎（Lumbar,L）L1-L3的CT影像学图像,应用Mimics 19.0、Geomagic Studio 11.0、ANSYS14.0软件建立完整L1-L3三维有限元模型A,模拟后路三维矫形手术操作构建坚强固定椎弓根钉系统内固定模型B和改良脊柱矫正系统内固定模型C,采用Von Mises应力峰值分析三套系统应力分布。运用三维有限元分析方法模拟生理负重（向L1椎体施加轴向500N的应力）和施加适当力矩（向L1椎体分别侧向施加10N.m力矩）的行前屈（Anteflexion,AF）、背伸（back extension,BE）、侧弯（1ateral bending,LB）、旋转（axial rotation,AR）等情况下比较分析正常脊柱模型及用两种矫正系统模拟矫正手术后应力分布特点、载荷分享情况、应变、弯曲刚度以及应变角度变化。结果:在轴向500N的应力作用下,再施加10N.m力矩做前屈、背伸、侧弯及水平旋转运动,前屈和背伸时,L1/2、L2/3椎间盘最大应力椎弓根钉系统B后均小于改良脊柱矫正系统C,而椎体的最大应力B系统在L1椎体应力是最大的而中间椎体L2的最大应力是最小的。在侧弯和旋转时B系统和C系统椎间盘的最大应力数字接近。通过计算应力遮挡率,C系统L1/2和L2/3椎间盘应力遮挡率和中间椎体L2椎体的应力遮挡率均明显小于B系统。前屈和后伸的角位移以及L1-L3的最大位移由小到大均是B<C<A,侧弯和旋转时角位移B和C是非常接近的,侧弯时的最大位移B和C也是接近的,但水平旋转的最大位移C要明显大于B。不同方向的弯曲刚度均为B>C>A。结论:改良脊柱矫正系统能够有效达到类似于脊柱固定的效果,并能够更好的载荷分享和减轻应力遮挡效应,从而为改良脊柱矫正系统的推广应用提供了依据。
刘硕[7]（2019）在《阿司匹林联合脂肪来源间充质干细胞治疗Ⅰ型成骨不全的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:成骨不全（osteogenesis imperfecta,OI）是一种以骨发育不良为主要特征的遗传病,最常见的病因是COL1A1或COL1A2基因突变所引起的Ⅰ型胶原合成不足或结构异常。目前临床上通过外科手术和双磷酸盐等药物进行治疗,无法改变胶原缺陷的根本。近年来,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）移植治疗取得了显着成效,有望纠正胶原的缺陷,但同时也面临着MSCs移植率低和移植的MSCs难以生长分化等亟待解决的问题。本研究拟检测阿司匹林对脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs）增殖、成骨分化和迁移等方面的影响,探讨阿司匹林影响ADSCs成骨分化和迁移的作用机制;并通过ADSCs和小剂量阿司匹林联合应用治疗成骨不全小鼠（osteogenesis imperfecta mice,oim）,探讨此方法在OI治疗中的可行性、有效性和安全性。方法:（1）从野生型C57BL/6小鼠的脂肪组织中分离培养原代ADSCs,培养至第三代时,利用流式细胞仪对ADSCs表面的干细胞相关标记分子进行鉴定;对ADSCs进行成骨、成脂诱导培养,并采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色、油红O染色对ADSCs的成骨、成脂分化潜能进行鉴定。（2）采用MTS法检测不同浓度（0、0.5、1、1.5、2、5、10mmol/L）阿司匹林对ADSCs增殖的影响;1.5 mmol/L阿司匹林处理ADSCs后用Annexin V标记凋亡细胞,利用流式细胞仪分析凋亡细胞所占比例,检测阿司匹林对ADSCs凋亡的影响。（3）将ADSCs分为对照组、单独成骨诱导组以及成骨诱导+阿司匹林组进行培养,通过ALP染色和ALP活性测定检测ADSCs的成骨分化情况;提取RNA后利用实时定量PCR（quantitative polymerase chain reaction,q-PCR）比较三组细胞成骨相关基因（Col1a1、Runx2、Bglap、Osterix、β-catenin、Bmp2）转录水平的变化。（4）通过划痕实验和Transwell实验比较溶剂对照组（DMSO组）和1.5mmol/L阿司匹林组ADSCs的迁移能力;采用q-PCR方法比较细胞基质衍生因子1（stromal cell-derived factor 1,SDF1）和趋化因子受体CXCR4（C-X-C chemokine receptor type 4）的转录水平,利用流式细胞仪分析两组中CXCR4阳性细胞所占比例,酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测两组细胞培养上清中SDF1蛋白的含量。（5）分离培养红色荧光蛋白（red fluorecent protein,RFP）转基因小鼠的ADSCs（RFP-ADSCs）,然后将oim小鼠分DMSO组、阿司匹林组、RFP-ADSCs组以及阿司匹林和RFP-ADSCs联合应用组进行治疗,野生型小鼠作为对照。3个月后,采用双能X射线吸收测定（dualenergy X-rayabsorptiometry,DXA）和Micro-CT对各组小鼠的股骨结构进行检测;将股骨组织制成石蜡切片,利用茜素红染色观察股骨矿化程度,利用免疫组化方法检测成骨相关因子的表达情况;通过ELISA方法检测各组小鼠血清中成骨相关因子的水平。结果:（1）经过流式细胞仪检测,培养至第三代的ADSCs高表达间充质干细胞相关标记分子CD29、CD44、CD90和Scal-1,低表达造血细胞相关标记分子CD45;成骨诱导后经ALP染色显示蓝紫色,成脂诱导后经油红O染色显示红色,证明成功分离培养出具有成骨、成脂分化潜能的ADSCs。（2）MTS实验结果显示,与对照组相比,经不同浓度阿司匹林处理的ADSCs增殖能力有不同程度的升高,且1.5 mmol/L浓度促进增殖作用最强,因此后续实验均选用此浓度;流式检测结果表明,经过1.5mmol/L阿司匹林处理的ADSCs的凋亡细胞比例明显低于对照组。（3）ALP染色及ALP活性检测结果表明,成骨诱导+阿司匹林组的ALP活性最强;q-PCR结果显示,单独成骨诱导组的Col1a1等成骨相关基因表达量显着升高,而成骨诱导+阿司匹林组显着高于单独成骨诱导组,且β-catenin和Bmp2的基因表达量最高,表明Wnt/β-catenin及BMP2途径可能是阿司匹林促进ADSCs成骨分化的通路。（4）划痕实验结果显示阿司匹林处理组的细胞迁移距离显着大于对照组,Transwell检测结果显示阿司匹林组迁移到小室背面的ADSCs数目明显多于对照组,两种实验结果都证明阿司匹林可使ADSCs的迁移能力有很大程度的提高;q-PCR结果显示,阿司匹林处理3天后Cxcr4和Sdf1的基因表达量显着高于对照组,流式结果显示阿司匹林组中CXCR4+细胞明显增多,ELISA结果表明阿司匹林组细胞培养上清中的SDF1含量显着高于对照组,表明SDF1-CXCR4途径是阿司匹林促进ADSCs迁移的通路之一。（5）分组对oim小鼠治疗3个月后,DXA和Micro-CT的检测结果显示阿司匹林与ADSCs联合治疗组小鼠的全身骨密度以及股骨的骨小梁数目等指标均有所升高;茜素红染色结果显示联合治疗组股骨的皮质骨矿化情况明显改善;免疫组化染色显示联合组治疗组的RFP标记显着多于ADSCs组,且联合组的股骨中成骨因子BGLAP和成血管因子CD31表达最多;ELISA检测表明联合治疗组血清中的成骨因子PⅠNP和细胞迁移因子SDF1水平最高,而破骨因子CTXⅠ和炎症因子COX2水平最低。结论:低、中浓度（0.52 mmol/L）的阿司匹林可促进ADSCs增殖,高浓度（510mmol/L）时则抑制增殖。1.5mmol/L的阿司匹林可抑制ADSCs凋亡,并且可能通过Wnt/β-catenin及BMP2途径促进ADSCs的成骨分化,通过SDF1-CXCR4途径促进ADSCs迁移。阿司匹林和ADSCs的联合应用可显着提高oim小鼠的骨密度和骨量,改善股骨微观结构,促进骨形成和血管生成,表现出良好的治疗效果,为OI的临床治疗提供了新的思路和方法。
孙静[8]（2018）在《流体剪切应力下二甲双胍对高糖致损骨细胞的作用研究和机制初探》文中指出背景和目的糖尿病是临床最常见的慢性代谢性内分泌病。随着改革开放后社会的飞速发展和人民群众物质文化需求的改变,糖尿病人越来越多,其发病率也是逐年增长,临床工作中发现在糖尿病各型病人中,2型糖尿病患者数量最多,而且发病年龄趋向于年轻化。在生活水平提高的同时,糖尿病患者对生活质量和审美的要求也越来越高,因此,国内糖尿病患者的牙齿正畸需求日趋旺盛,而异常的高糖（high glucose,HG）状态和晚期糖基化终末产物会导致全身骨代谢紊乱,破坏牙槽骨骨代谢的平衡,严重影响了正畸的疗效,这已经成为临床正畸治疗亟待解决的问题之一。与其它骨骼一样,牙槽骨的稳态也是通过骨吸收和骨形成之间的动态平衡来维持。正畸牙齿移动依靠机械力引起的牙槽骨改建,受压力侧破骨细胞活性增强引起牙槽骨吸收,受张力侧成骨细胞活性增强形成新骨。牙齿受到机械力的刺激后便会激活牙槽骨的重建。近来研究表明,骨细胞是早期机械性骨重建的主要靶点。骨细胞是骨组织中最丰富的细胞,具有细胞突起,突起间的间隙连接将多个骨细胞连接在一起,构成星网状结构,使细胞信号可以在多个细胞间传递,使代谢产物在此通道内交流和互换。骨细胞在体内的受力形式为外界应力作用于骨,刺激骨陷窝小管中的组织液流动,产生作用于骨细胞的流体剪切应力。大量实验亦证明,在体外环境中,骨细胞较为敏感的力学刺激信号是流体剪切应力。骨细胞作为机械感受细胞,感受外界应力刺激,并将生物力学信号转化为生物化学信号传递给其他骨组织细胞,如成骨细胞、破骨细胞等来控制骨吸收和骨形成,是整个牙槽骨代谢的重要调控者。二甲双胍（Metformin,MF）是目前临床上治疗2型糖尿病的一线药物,降糖作用显着。近来研究发现,二甲双胍除了降糖作用以外,还具有很多作用,尤其是二甲双胍对骨的直接保护作用成为研究的热点。但是,目前关于糖尿病对正畸牙移动的不利影响,以及二甲双胍对骨代谢有何作用的研究报道大都集中在成骨细胞和破骨细胞上,而二者对于骨细胞的影响则鲜见报道。鉴于骨细胞在调控骨改建过程中的重要作用,在本实验中,我们在体外建立流体剪切应力施加模型,运用小鼠骨样细胞系MLO-Y4作为研究对象,研究在流体剪切应力下,高糖对骨样细胞MLO-Y4的影响,二甲双胍干预对高糖致损骨样细胞的作用以及高糖处理和二甲双胍处理的骨样细胞上清液对成骨细胞和破骨细胞会产生何种诱导效应;在体内建立大鼠2型糖尿病正畸牙齿移动模型,施加二甲双胍,研究二甲双胍在2型糖尿病大鼠牙移动过程中对骨细胞及骨改建的作用,并从组织学的角度寻找二甲双胍影响牙槽骨骨细胞的证据。总之,本课题通过体内体外实验研究二甲双胍在流体剪切应力和高糖环境下对骨细胞的影响及机制,从骨代谢重要调控者--骨细胞的角度,为临床糖尿病正畸患者提供治疗思路和有力的理论依据。材料与方法1.流体剪切应力下,高糖对骨样细胞MLO-Y4的影响在施加流体剪切力的基础上,以不同浓度葡萄糖（5.5、11、22、33、44、66mM）干预骨样细胞MLO-Y4,葡萄糖（5.5 mM）为对照组,应用细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖情况;流式细胞仪测细胞凋亡率;细胞免疫荧光技术测施加流体剪切应力对MLO-Y4细胞的影响;矿化诱导测不同葡萄糖浓度下骨样细胞的矿化情况;qRT-PCR和Western blot技术检测各标志物mRNA和蛋白的变化。2.流体剪切应力下,二甲双胍对高糖致损骨样细胞的作用以及高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞上清液对成骨细胞和破骨细胞生物学特性的影响2.1流体剪切应力下,二甲双胍对高糖致损骨样细胞MLO-Y4的作用在施加流体剪切力的基础上,将骨样细胞进行两种不同的处理:1)使用HG22mM高糖培养基培养2周后,添加不同浓度的二甲双胍,继续培养;2)使用HG22mM高糖培养基培养2周后,更换为普通培养基,并添加不同浓度的二甲双胍,继续培养。设置葡萄糖（5.5 mM）复合二甲双胍（0μM）为对照组,应用细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖情况;流式细胞仪测细胞凋亡率;矿化诱导检测不同葡萄糖浓度下骨样细胞的矿化情况;qRT-PCR和Western blot技术检测各标志物mRNA和蛋白的变化。2.2高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞MLO-Y4上清液对成骨细胞和破骨细胞生物学特性的影响收集上述不同处理的骨样细胞培养上清液,培养小鼠前成骨细胞MC3T3-E1,运用流式细胞仪检测不同处理的骨样细胞培养上清液对成骨细胞凋亡的影响;矿化诱导测成骨细胞的矿化能力;qRT-PCR和Western blot技术检测各成骨相关标志物mRNA和蛋白的变化。使用小鼠RAW264.7细胞诱导破骨细胞,并在诱导过程中施加不同处理的骨样细胞培养上清液,观察其对破骨细胞形成数目和功能的影响。3.流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨样细胞MLO-Y4的机制初探3.1生物信息学分析通过DrugBank数据库,找到二甲双胍的作用靶点,然后,通过String数据库,找到10个与二甲双胍的作用靶点PRKAB1密切相关的基因,然后通过KEGG数据库、GO数据库和上述基因来预测二甲双胍参与调控的生物学过程和影响到的信号通路。3.2 Western Blot 实验检测流体剪切应力下,高糖培养基（HG22mM）培养骨样细胞14d,更换无血清培养基培养12h,之后添加1M二甲双胍,在Omin,5min,15min,30min,60min,90 min,2h-10h,收集细胞蛋白,Western blot技术检测不同信号通路随时间点的变化。4.流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨细胞的体内研究购买SPF级Wistar大鼠并建立2型糖尿病大鼠模型,设置上颌第一磨牙近中移动加力装置,一组经胃灌注给予100mg/kg/day的二甲双胍（二甲双胍组）,另一组给予同量生理盐水作为对照（糖尿病组）;正常大鼠复合正畸组作为空白对照（正常组）。每周称量体重,同时检测血糖水平,正畸2周后麻醉,口内取模测量牙齿移动距离,4%多聚甲醛心脏灌注法处死动物,取上颌骨行固定、脱钙、制作石蜡切片,伊红-苏木素（HE）染色观察牙槽骨组织形态的变化;抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）复合碱性磷酸酶（ALP）双重染色,观察破骨细胞和成骨细胞的变化;免疫组织化学染色观察骨细胞标志物硬骨素（sclerostin,SOST）,牙本质基质蛋白-1（dental matrix protein-1,DMP-1）的表达变化。结果1.流体剪切应力下,高糖对骨样细胞MLO-Y4的影响1)细胞免疫荧光显示:流体剪切应力施加组,F-actin蛋白亮度明显增加,细胞突触增长;2)CCK-8法检测细胞增殖和流式细胞仪检测细胞的凋亡率,结果显示:MLO-Y4细胞在葡萄糖作用3天后,11、22mM葡萄糖组,呈剂量依赖式促进细胞增殖（p<0.05）,降低细胞凋亡率（P<0.05）。而33、44、66mM葡萄糖组抑制细胞增殖（P<0.05）,促进细胞的凋亡（p<0.05）,66mM组促凋亡作用最为明显（P<0.01）;3)矿化诱导结果显示:随着葡萄糖浓度的增高,矿化结节形成减少,钙含量呈剂量依赖式降低（p<0.05）;4)qRT-PCR和WB结果显示:随着葡萄糖浓度（5.5-66mM）的升高,OPN,OCN,DMP-1的表达呈剂量依赖式递减;SOST的表达和RANKL/OPG的比值呈剂量依赖式递增。2.流体剪切应力下,二甲双胍对高糖致损骨样细胞的作用以及高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞上清液对成骨细胞和破骨细胞生物学特性的影响2.1流体剪切应力下,二甲双胍对高糖致损骨样细胞MLO-Y4的作用2.1.1在流体剪切应力和高糖环境下,添加不同浓度的二甲双胍（MF0-800μM）1)CCK-8检测增殖活性和流式细胞仪检测凋亡率,结果显示:不同浓度的MF（100-800μM）,均可促进MLO-Y4细胞的增殖,降低其凋亡率,峰值出现在MF400μM。2)矿化诱导结果显示:不同浓度的MF（100-800μM）,均能促进MLO-Y4细胞的矿化,以MF100μM浓度的作用最为明显。3)qRT-PCR结果显示:在MF 100-2000μM范围内,OCNmRNA,OPNmRNA的表达增高,在 MF 100μM 时达到峰值;在添加 MF 400-800μM 时,OCNmRNA,OPNmRNA的表达降低,MF800μM下降的幅度较大;在MF100-800μM范围内,DMP-1mRNA的表达呈剂量依赖式增高,SOSTmRNA的表达呈剂量依赖式降低;RANKL/OPGmRNA的比值呈剂量依赖式下降。4)WB结果显示:低浓度MF 100-200μM,可以在一定程度上缓解高糖对OCN、OPG、DMP-1的抑制作用,高浓度MF 400-800μM,缓解作用明显。同时,低浓度MF 100-200μM可以在一定程度上降低高糖对SOST,RANKL的促进作用,高浓度MF 400-800μM作用更明显。2.1.2在流体剪切应力和高糖环境下培养细胞14天后,更换普通培养基,并添加二甲双胍（MF0-800μM）1)MF0-400μM,均能促进细胞增殖,降低细胞凋亡率,峰值出现在MF 100μM,而添加MF800μM会抑制细胞增殖,促进其凋亡。2)矿化诱导结果显示:不同浓度MF0-800μM,均能明显的促进骨样细胞MLO-Y4的矿化,MF2000μM浓度作用最为明显。3)在MF100-800μM范围内,OCNmRNA、OPNmRNA的表达均增加,在添加MF200μM时OCNmRNA、OPNmRNA的表达达到峰值;在MF 100-800 μM范围内,DMP-1mRNA表达增高,SOSTmRNA表达降低;在施加MF400μM时,DMP-1mRNA表达量最高,SOSTmRNA表达量最低;RANKL/OPGmRNA的比值呈剂量依赖式下降。4)WB结果显示:相比对照组,添加二甲双胍组别能明显的促进骨样细胞MLO-Y4中OCN、OPG、DMP-1蛋白的表达,降低RANKL和SOST蛋白的表达。2.2高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞MLO-Y4上清液对成骨细胞和破骨细胞生物学特性的影响2.2.1高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞MLO-Y4上清液对成骨细胞的影响1)流式细胞仪检测凋亡结果显示:在按1:1比例添加正常成骨细胞培养液加各种不同处理骨样细胞上清液后,高糖骨样细胞上清液和高糖加MF 200μM组凋亡率增高,高糖更换普通培养基并添加二甲双胍组,凋亡率降低。2)矿化诱导结果:高糖骨样细胞上清液处理组,矿化结节形成的最少,高糖加二甲双胍组较高糖组增多,但是对比正常对照组和单纯二甲双胍处理组仍较低。而高糖更换普通培养液并添加二甲双胍组,矿化结节呈剂量依赖式增多。3)qRT-PCR和Western结果显示:高糖骨样细胞上清液组中COL I、OPG和OCN表达明显降低,高糖加MF200μM组中上述因子的表达有所提升,但相比正常对照组和单纯MF处理组仍较低;而在高糖更换普通培养基并加二甲双胍组COL-I呈剂量依赖式增加;OPG、OCN在MF200-400μM范围内呈剂量依赖式增加。RANKL在高糖骨样细胞上清液组和高糖加200μM二甲双胍组均表达较高,在高糖更换普通培养基并加MF组,RANKL表达呈剂量依赖式降低。2.2.2高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞MLO-Y4上清液对破骨细胞的影响1)破骨细胞数目:高糖处理骨样细胞上清液能明显促进破骨细胞的生成,破骨细胞形成多且面积较大;高糖复合MF处理骨样细胞上清液能改善高糖对破骨细胞生成的影响,降低破骨细胞的数量和面积;高糖更换普通培养基后再添加MF组,呈剂量依赖式抑制破骨细胞的形成。2)破骨细胞功能:高糖处理骨样细胞上清液组,破骨细胞功能活跃,形成的骨陷窝面积最大;高糖复合MF骨样细胞上清液组,破骨细胞的功能较高糖组减弱;高糖更换普通培养基后再添加MF组,破骨细胞形成的陷窝面积呈剂量依赖式减少,差异有统计学意义。3.流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨样细胞MLO-Y4的机制初探3.1.生物信息分析1)通过Drugbank数据库,查询到二甲双胍的作用靶点为5’-AMP-activated protein kinase subunit beta-1,基因名为 PRKAB1。通过 String 数据库中查询到 10 个与 PRKAB1 密切相关的基因:PRKAG1、PRKAA2、PRKAA1、PRKAG2、PRKAG3、STK11、ULK1、ACACA、TP53、MTOR;2)通过 KEGG 数据库检索到二甲双胍涉及的信号通路主要有:AMPK、mTOR、Adipocytokine、Insulin、Regulation of autophagy、Glucagon、Insulin resistance、Circadian rhythm、Non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）、Oxytocin 信号通路。其中,与二甲双胍关系最为密切的信号通路是AMPK信号通路（pValue:1.03E-31）;3)通过GO数据库,检索到二甲双胍涉及的生物学进程主要有细胞周期停滞、蛋白磷酸化、大自噬、p53类调控因子介导的信号转导调控、脂肪酸生物合成进程、基因表达正向调控、营养水平的细胞反应、自噬的正向调控、肉碱穿梭、前列腺素E激活的细胞反应等密切相关。3.2.Western Blot 实验检测在二甲双胍作用于高糖致损的骨样细胞后,p-Ampk,p-Erk,和p-Jnk的表达量随时间变化（5min-10h）呈现出表达升高-降低等周期性的变化。p38和NF-κB信号通路中的p-p65在检测的时间段（5min-10h）未见表达的改变。4.流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨细胞的体内研究1)2型糖尿病大鼠正畸牙齿模型成功建立,血糖值明显高于正常对照组（p<0.05）,二甲双胍用药组血糖值与正常组无明显差异（p<0.05）;2)二甲双胍组较糖尿病组牙齿移动距离减少（p<0.05）,与正常组无统计学差异（p>0.05）;3)二甲双胍组与糖尿病组相比,破骨细胞减少,ALP表达增强（p<0.05）,与正常组比较无统计学差异（p>0.05）;4)免疫组织化学染色显示,二甲双胍组相较于糖尿病组,骨细胞中SOST阳性骨细胞所占比值减少,而DMP-1阳性骨细胞所占比值增加（p<0.05）,上述因子表达与正常组比较无明显差异（p>0.05）。结论1.流体剪切应力下,低浓度高糖（11mM-22mM）可以促进骨样细胞的增殖和活性,高浓度高糖（33mM-66mM）则抑制骨样细胞的增殖和活性,促进其凋亡;随着葡萄糖浓度的增高（1 1mM-66mM）,正向调控矿化相关因子OPN,OCN,DMP-1的表达呈剂量依赖式递减,负向调控矿化因子SOST的表达和RANKL/OPG的比值呈剂量依赖式递增,骨样细胞矿化能力减弱。2.流体剪切应力下,二甲双胍可以改善高糖致损骨样细胞的增殖活性和功能,使高糖诱导表达升高的SOST表达下调,表达降低的DMP-1表达上调,进而影响骨样细胞对成骨细胞和破骨细胞的调控功能,增加骨形成能力和降低骨吸收能力。同时,在流体剪切应力下,二甲双胍在高糖环境中,需要一定的浓度来改善高糖致损骨样细胞的活性和对成骨破骨的调控功能;而在正常葡萄糖环境中,二甲双胍则可以较好地逆转高糖致损骨样细胞的活性和对成骨破骨的调控功能。3.流体剪切应力作用下,AMPK、ERK、JNK信号通路参与了二甲双胍对高糖致损骨样细胞的调控。而p38信号通路,NF-κB信号通路（p65）未参与该调控过程。4.糖尿病使骨细胞高表达SOST,低表达DMP-1,增强了正畸力作用下破骨细胞的数目和活性,损伤了成骨细胞的功能,导致了牙齿移动距离加大。应用二甲双胍干预后,二甲双胍逆转了糖尿病对骨细胞的损害,使SOST和DMP-1的表达趋于正常化,降低了破骨细胞的数量和活性,并在一定程度上改善了成骨细胞活性,促使牙齿移动正常化。
牛茜楠[9]（2018）在《机械牵张应力下Cofilin调节NF-κB对成骨细胞成骨效应影响的分子机制研究》文中认为力学刺激在骨代谢中发挥着举足轻重的调节作用。在人体骨骼结构及人类日常生活中,生物力学刺激对骨组织的新陈代谢起着非常重要的作用。骨量的维持依赖于机械力学刺激,同时骨量又对机械力学刺激发生适应性改建。适宜的牵张应力可以在牵张成骨、骨折修复、正畸牙齿移动等许多临床治疗中刺激骨组织自身的生长与重建,达到促进新骨形成的目的,重复增加的负荷,如定期规律地运动,也可以诱导新的骨形成,而缺乏力学刺激如长期卧床、神经肌肉麻痹或航天飞行等情况下力学负荷减少,承重骨骼中的骨质量就会丧失。在过去的几十年里,骨细胞逐渐被大家公认为是骨骼内的应力感受细胞和效应细胞,骨细胞通过将外部机械力转化为生物化学反应来协调重塑过程,这是一种称为机械转导的过程。探索成骨细胞的生物力学信号转导机制对于阐明骨改建的机理,发现调控骨生长的新靶点具有重要意义。NF-κB是参与骨代谢,调节炎症,影响先天性和适应性免疫反应的最重要的转录因子之一1,2。在骨骼形成方面,NF-κB信号直接参与破骨细胞的分化和活化3,4。慢性NF-κB激活沿着成骨途径影响间充质干细胞（mesenchym al stem cell,MSC）分化,削弱成骨细胞介导的骨形成5。众多学者的研究提示NF-κB参与机械应力刺激下细胞内的反应过程。而NF-κB的激活即RelA/p65（NF-κB亚基）向细胞核的易位需要肌动蛋白细胞骨架的动态改变;干扰肌动蛋白细胞骨架的改变会抑制RelA/p65的核聚集7。因此,肌动蛋白细胞骨架重塑可能会影响NF-κB活性并参与一系列反应。在本课题组的前期工作中对机械牵张应力加载前后的成骨细胞进行了蛋白质组学分析,其中细胞骨架调节蛋白--丝切蛋白Cofilin的表达在加载后显着增高,并明确了Cofilin在机械应力刺激中对成骨分化的积极作用6。Cofilin是一种肌动蛋白结合蛋白,通过刺激肌动蛋白丝的切断和去聚合作用,在肌动蛋白丝动力学和重组过程中发挥重要作用8,Cofilin作为影响调控细胞骨架蛋白的重要因子也同样是力学敏感蛋白,综上考虑,本研究推测成骨细胞内,Cofilin对NF-κB同样有调控作用,并设计了两部分研究内容:第一部分机械牵张应力作用下NF-κB对成骨细胞成骨效能的影响目的:探索机械牵张应力作用下,NF-κB对成骨细胞成骨效能的影响;方法:应用慢病毒转染的方法分别建立成骨细胞MG63内RelA（NF-κB的主要亚基）过表达与下调的模型,随后应用Flexcell细胞力学加载系统对不同RelA表达情况的成骨细胞MG63加载12%的静态牵张力,并设置1h、4h、8h、12h不同加力时长,同时设置不加力对照组,加力完成后收集细胞,使用酶动力学法检测不同分组细胞碱性磷酸酶表达情况,茜素红染色检测钙结节形成,Elisa法检测骨钙素与I型胶原分泌并使用实时定量RT-PCR的方法检测成骨相关重要基因Runx-2、Osterix和I型胶原的表达;结果:RelA过表达的MG63组细胞在加载机械牵张应力后,不同加力时长成骨细胞内成骨相关蛋白及基因表达有所不同,随着加力时间的延长,成骨相关ALP,骨钙素以及I型胶原的表达均出现了小幅增长,随后下降的趋势;相比于MG63组细胞,RelA过表达组的三种成骨相关蛋白增长趋势较弱,同时需要较长时间的牵张力刺激,钙结节的表达情况也明显低于MG63组。RT-PCR检测了Runx-2、Osterix和I型胶原的基因表达情况,结果与蛋白表达相关实验结果呈现相类似的变化趋势。而RelA下调MG63组的细胞,成骨相关蛋白表达显着高于正常细胞组,成骨相关基因的表达也远高于正常细胞组,同时只需要相对较短的加力时长,加力仅1h就出现成骨相关蛋白与基因表达的显着增高;结论:机械牵张应力刺激下,成骨细胞的成骨性能发生显着变化;不同时长的12%静态牵张力对成骨细胞成骨性能影响不同。NF-κB在机械牵张应力刺激下对成骨细胞的成骨性能发挥着显着的负向调控作用。本研究深入研究了机械牵张应力作用下成骨细胞内NF-κB的作用,为理解机械力学刺激下成骨细胞内的作用机制提供了一定的理论基础。第二部分机械牵张应力作用下成骨细胞内Cofilin对NF-κB的调控机制研究目的:系统探讨机械牵张应力作用下成骨细胞内Cofilin的表达和NF-κB活性之间的关系,以明确机械牵张应力能否通过上调Cofilin表达进而抑制NF-κB活性从而促进成骨;方法:应用慢病毒转染的方法分别上调和下调成骨细胞MG63内Cofilin的表达,对细胞加载12%的静态牵张力,并设置15min、30min、45min、60min不同加力时长,同时设置不加力对照组,加力完成后收集细胞,应用Western Blotting分别检测细胞全蛋白内NF-κB激活相关重要蛋白IκBα,p-IκBα,IKK和p-p65的表达和细胞核蛋白内p-p65的表达,并通过双荧光素酶报告基因的方法验证NF-κB与启动子DNA结合的能力变化,以及Cofilin对NF-κB的调节作用;结果:细胞全蛋白WB的结果显示相比于Cofilin过表达MG63组与MG63组,Cofilin下调MG63组NF-κB的抑制蛋白IκBα降低较快且更明显,同时p-p65也很快在细胞中聚集,并通过核蛋白WB的结果看到p-p65明显发生核内聚集移位,表明Cofilin下调MG63组NF-κB的激活较快发生,并且能在不同时长的加力中仍保持激活状态;双荧光素酶报告基因结果证实了Cofilin下调MG63组NF-κB与启动子DNA的结合能力较强,并需要较短时间的机械力刺激就可显着提高其活力;结论:机械牵张应力作用下,成骨细胞内NF-κB活性发生显着变化,适当时长的机械牵张应力可以有效激活NF-κB,其中加力30min时成骨细胞内NF-κB活性最高,与启动子DNA结合能力最强;机械牵张力作用下,Cofilin对NF-κB发挥着显着的负向调控作用,机械牵张应力可以通过上调Cofilin的表达抑制NF-κB的活性,继而促进成骨细胞成骨分化,证实了Cofilin可以通过抑制NF-κB的表达来促进成骨细胞的成骨性能。
杜挺媛,张舒,曹新生,王冰[10]（2012）在《流体剪切应力对模拟微重力下MG-63细胞骨架系统的影响》文中提出目的观察水平回转模拟微重力（modeled microgravity,MMG）后人骨肉瘤MG-63细胞受流体剪切应力（flow shear stress,FSS）作用后细胞骨架的改变,探讨模拟微重力情况下骨质丢失的细胞学机制。方法 MG-63成骨细胞采用回转器水平回转培养48 h模拟微重力效应,同时设静止培养为对照组。之后,细胞随机分为两组,一组利用流室系统实施FSS,FSS设为1.5 Pa,作用时间60 min,另一组无FSS作用。细胞经过免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架系统的变化。结果 FSS作用后,MG-63细胞微丝和微管的形态和分布均发生变化,微丝可见多束状排列,荧光强度增强,出现粗的应力纤维;微管可见其极性中心移向细胞质外缘,细胞外层荧光量加重,有少量束状结构出现。MMG后,MG-63细胞的细胞骨架发生解聚和重排,微丝向核周集聚;微管发生断裂,变短,弯曲等变化。MMG后,再给予FSS刺激,微丝未能形成应力纤维,仅见微丝、微管在应力方向有拉长。结论 1.5 Pa,60 min流体剪切应力未能在回转模拟微重力后成骨细胞内诱导形成应力纤维。
二、不同重力环境对流体剪切应力诱导成骨细胞环氧合酶-2蛋白表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同重力环境对流体剪切应力诱导成骨细胞环氧合酶-2蛋白表达的影响（论文提纲范文）
（1）TRPM7介导膝骨关节炎中滑膜巨噬细胞M1型极化的机制研究及膝痹宁方的干预作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 理论研究 |
| 第一节 KOA的现代医学研究进展 |
| 1 流行病学 |
| 2 发病机制 |
| 3 治疗进展 |
| 第二节 膝痹宁方治疗KOA的理论依据 |
| 1 膝骨关节炎病因病机沿革 |
| 2 膝痹宁方方解和现代医学根据 |
| 第三节 巨噬细胞极化调控KOA病理过程 |
| 1 巨噬细胞极化简述 |
| 2 巨噬细胞极化在OA中的作用研究进展 |
| 3 以巨噬细胞极化作为OA靶标的治疗方法研究现状 |
| 第四节 机械应力调控巨噬细胞极化研究进展 |
| 1 机械应力通过巨噬细胞调控组织器官内炎症环境 |
| 2 机械应力调控巨噬细胞极化研究进展 |
| 第五节 力学敏感离子通道瞬时电位受体M7 |
| 第六节 研究假说 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 TRPM7介导KOA模型小鼠关节滑膜巨噬细胞M1型极化机制研究 |
| 1 KOA模型小鼠膝关节滑膜巨噬细胞极化表型探究 |
| 2 TRPM7对循环牵张力诱导的小鼠巨噬细胞极化的介导作用 |
| 3 循环牵张力通过TRPM7-ERK1/2及NF-κB通路诱导小鼠巨噬细胞M1型极化 |
| 4 TRPM7抑制剂对KOA模型小鼠滑膜炎症、软骨退变及滑膜巨噬细胞极化的影响 |
| 第二节 膝痹宁方阻抑TRPM7介导的滑膜巨噬细胞M1型极化干预KOA的机制研究 |
| 1 膝痹宁方对KOA模型小鼠滑膜炎症、软骨退变的干预作用 |
| 2 膝痹宁方抑制TRPM7-ERK及NF-κB通路激活阻抑滑膜巨噬细胞M1型极化 |
| 结论 |
| 本研究的创新与不足 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）流体剪切力介导Piezo1机械敏感性离子通道对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨质疏松症的研究现状 |
| 1.2 成骨细胞所处的力学微环境 |
| 1.3 Piezo1机械敏感性离子通道 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂配制 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.2.1 细胞换液 |
| 2.2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.2.3 细胞冻存及复苏 |
| 2.2.3 流体剪切力加载 |
| 2.2.4 免疫荧光染色 |
| 2.2.5 Western Blot实验 |
| 2.2.6 EdU染色 |
| 2.2.7 鬼笔环肽染色 |
| 2.3 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 不同条件FSS对成骨细胞内Piezo1表达的影响 |
| 3.1.1 循环与间停模式FSS对成骨细胞内Piezo1表达的影响 |
| 3.1.2 不同强度循环FSS对成骨细胞Piezo1表达的影响 |
| 3.2 FSS介导Piezo1通过ERK5、ERK1/2通路促进成骨细胞增殖 |
| 3.2.1 Yoda1和GsMTx4对成骨细胞Piezo1蛋白的影响 |
| 3.2.2 Piezo1影响成骨细胞增殖 |
| 3.2.3 Piezo1蛋白影响ERK5、ERK1/2磷酸化 |
| 3.2.4 FSS对成骨细胞增殖及ERK5、ERK1/2通路的影响 |
| 3.3 FSS通过细胞骨架影响成骨细胞增殖 |
| 3.3.1 FSS及Piezo1对成骨细胞细胞骨架的影响 |
| 3.3.2 FSS通过细胞骨架影响成骨细胞增殖 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 机械敏感性离子通道在骨关节炎中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 中英文缩略词表 |
（3）NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 TMJOA患者与TMJID患者颞下颌关节滑液焦亡相关炎性介质的表达研究 |
| 1 研究内容及方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在大鼠TMJOA组织的表达研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及材料 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 流体剪切力干预对软骨细胞焦亡的作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 靶向NLRP3炎性小体治疗炎症疾病 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（4）DNA甲基化在运动干预骨质疏松中的作用机制（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 纳入和排除标准 |
| 2 结果Results |
| 2.1 DNA甲基化 |
| 2.2 DNA甲基化与骨质疏松症 |
| 2.2.1 单基因水平中的DNA甲基化 |
| 2.2.2 Wnt/β-catenin、Notch信号通路与DNA甲基化 |
| 2.2.3 OPG/RANKL/RANK系统与DNA甲基化 |
| 2.3 DNA甲基化在运动影响骨质疏松症中的作用研究 |
| 2.3.1 运动产生的机械效应与骨质疏松症 |
| 2.3.2 DNA甲基化在运动调控骨质疏松症中的作用机制 |
| 3 研究展望Prospects |
（5）麝香乌龙丸对CIA小鼠滑膜S1P代谢情况评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验药品 |
| 1.1.3 主要试剂及相关试剂配备 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 建立CIA动物模型 |
| 1.2.2 动物分组 |
| 1.2.3 药品制备及给药治疗 |
| 1.2.4 取材 |
| 1.2.5 相关指标的观测 |
| 1.2.6 统计学处理 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 小鼠滑膜液中TNF-α, IL-6,S1P、IFN-γ和血清中S1P的表达水平 |
| 1.3.2 小鼠滑膜中SphK1、S1P和S1PL的阳性表达 |
| 1.3.3 小鼠滑膜中SphK1、S1P和S1PL的蛋白表达 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 麝香乌龙丸遣方用药及现代药理研究 |
| 1.4.2 CIA模型的选择和制备 |
| 1.4.3 相关结果分析 |
| 1.4.4 S1P和血管新生 |
| 1.4.5 S1PL对炎症影响 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 S1P代谢对类风湿性关节炎的影响 |
| 2.1 RA与血管翳 |
| 2.2 S1P在RA发病中的作用 |
| 2.2.1 S1P与SPHKS、S1PL |
| 2.2.2 S1P受体的作用和对RA炎症的影响 |
| 2.3 S1P与血管新生 |
| 2.4 S1P和骨损伤 |
| 2.5 RA与络病 |
| 2.6 中药治疗S1P |
| 2.7 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（6）改良脊柱矫正系统的有限元分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 建立正常腰椎L1-L3有限元模型 |
| 1.2.2 腰椎L1-L3活动节段有限元模型有效性验证 |
| 1.2.3 建立椎弓根钉矫正系统和改良脊柱矫正系统的内固定有限元模型 |
| 1.2.4 用有限元模拟经后路两套系统的三维矫正及内固定融合手术操作 |
| 1.2.5 应力实验和评估指标 |
| 2 结果 |
| 2.1 有限元模型验证结果 |
| 2.2 不同应力状态下的L1-L3的应力、应变分析 |
| 2.2.1 不同应力状态下的椎间盘最大应力 |
| 2.2.2 不同应力下椎体的最大应力 |
| 2.2.3 不同应力作用下的椎间盘和中间椎体的应力遮挡率 |
| 2.2.4 不同应力状态下的角位移和弯曲刚度 |
| 2.2.5 不同应力状态下的L1-L3的最大位移 |
| 3 讨论 |
| 3.1 改良脊柱矫正系统的介绍 |
| 3.2 关于横突钩与横突的契合问题 |
| 3.3 尸体标本的生物力学情况 |
| 3.4 有限元分析仿真生物力学实验 |
| 3.4.1 在矢状面的应力应变分析 |
| 3.4.2 在冠状面的应力分析 |
| 3.4.3 在水平面的应力分析 |
| 3.4.4 两套系统的应力遮挡比较分析 |
| 3.4.5 两套系统的临近节段应力应变探讨 |
| 3.5 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脊柱生物力学与组织工程研究综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（7）阿司匹林联合脂肪来源间充质干细胞治疗Ⅰ型成骨不全的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、阿司匹林对小鼠ADSCs成骨分化的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂、耗材及仪器 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 小鼠ADSCs的分离、培养及鉴定 |
| 1.2.2 阿司匹林对小鼠ADSCs的增殖及凋亡的影响 |
| 1.2.3 阿司匹林对小鼠ADSCs的成骨分化的影响 |
| 1.2.4 阿司匹林对小鼠ADSCs迁移能力的影响 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 小鼠ADSCs的培养及鉴定 |
| 1.3.2 阿司匹林对ADSCs的增殖及凋亡的影响 |
| 1.3.3 阿司匹林对ADSCs成骨分化的影响 |
| 1.3.4 阿司匹林对ADSCs迁移能力的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 二、阿司匹林联合ADSCs对成骨不全模型小鼠的治疗 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂、耗材及仪器 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 oim小鼠基因型的鉴定 |
| 2.2.2 阿司匹林联合ADSCs对 oim小鼠进行治疗 |
| 2.2.3 各组治疗效果评价 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 oim小鼠的基因型检测 |
| 2.3.2 各组小鼠的体重变化 |
| 2.3.3 DXA结果 |
| 2.3.4 Micro-CT结果 |
| 2.3.5 茜素红染色结果 |
| 2.3.6 免疫组化结果 |
| 2.3.7 血清因子检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 阿司匹林应用于骨相关疾病治疗的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）流体剪切应力下二甲双胍对高糖致损骨细胞的作用研究和机制初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 流体剪切应力下不同浓度高糖对骨样细胞MLO-Y4的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 流体剪切应力下二甲双胍对高糖致损骨样细胞MLO-Y4的改善作用及高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞上清液对成骨细胞和破骨细胞的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 流体剪切应力下二甲双胍调控高糖致损骨样细胞MLO-Y4的机制初探 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨细胞的体内研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读博士期间发表的代表性论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）机械牵张应力下Cofilin调节NF-κB对成骨细胞成骨效应影响的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 从机械应力刺激到骨骼形成 |
| 1.1 骨骼的基本结构 |
| 1.2 机械传感器 |
| 2 细胞骨架蛋白与机械力学传导 |
| 2.1 细胞骨架蛋白的基本结构 |
| 2.2 细胞骨架在机械信号转导中的作用 |
| 2.3 ADF/Cofilin蛋白家族对细胞骨架的调控 |
| 2.4 cofilin与机械力学传导 |
| 3 NF-κB与机械力学传导 |
| 3.1 NF-κB蛋白家族 |
| 3.2 NF-κB与机械力学传导 |
| 3.3 NF-κB在成骨细胞中的作用机制 |
| 4 NF-κB与Cofilin间的相互作用机制研究现状 |
| 第一部分 机械牵张应力作用下NF-ΚB对成骨细胞成骨效能的影响 |
| 实验一、成骨细胞内构建NF-ΚB(RELA)过表达及NF-ΚB(RELA)下调模型 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 预实验确定慢病毒转染MG63细胞的MOI(multiplicity of infection)值 |
| 2.3 分别建立稳定过表达RelA、下调RelA的MG63细胞模型 |
| 2.4 实时定量PCR验证慢病毒转染效率 |
| 2.5 Western Blotting检测蛋白表达变化 |
| 2.6 应用嘌呤霉素建立RelA过表达及下调的稳定细胞株 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 确定慢病毒转染MG63细胞的最佳转染条件与MOI |
| 3.2 应用实时定量RT-PCR检测慢病毒转染效果 |
| 3.3 Western Blotting检测慢病毒转染效率 |
| 4 讨论 |
| 实验二、机械牵张应力对过表达NF-ΚB(RELA)的成骨细胞成骨性能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞加载牵张力 |
| 2.2 酶动力学法检测碱性磷酸酶(ALP)活力 |
| 2.3 茜素红染色检测加力后细胞钙结节形成能力变化 |
| 2.4 应用Elisa检测骨钙素(osteocalcin,OC)、Ⅰ型胶原分泌变化 |
| 2.5 实时定量PCR检测成骨相关基因表达 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA过表达MG63组ALP的活性变化 |
| 3.2 不同SMS加载时长下,应用茜素红染色检测MG63组与RelA过表达的MG63组钙结节形成能力 |
| 3.3 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA过表达的MG63组分泌骨钙素及Ⅰ型胶原的情况 |
| 3.4 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA过表达的MG63组成骨相关基因的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 实验三、机械牵张应力对NF-ΚB(RELA)下调的成骨细胞成骨性能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞加载牵张力 |
| 2.2 酶动力学法检测碱性磷酸酶(ALP)活力 |
| 2.3 茜素红染色检测加力后细胞钙结节形成能力变化 |
| 2.4 应用Elisa检测骨钙素(osteocalcin,OC)、Ⅰ型胶原分泌变化 |
| 2.5 实时定量PCR检测成骨相关基因表达 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA过表达MG63组ALP的活性变化 |
| 3.2 不同SMS加载时长下,应用茜素红染色检测MG63组与RelA过表达的MG63组钙结节形成能力 |
| 3.3 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA下调MG63组分泌骨钙素及Ⅰ型胶原的情况 |
| 3.4 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA下调MG63组成骨相关基因的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 机械牵张应力作用下成骨细胞内COFILIN对NF-ΚB的调控机制研究 |
| 实验一、成骨细胞内构建COFILIN过表达及COFILIN下调模型 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 分别建立稳定过表达Cofilin、下调Cofilin的MG63细胞模型 |
| 2.3 实时定量PCR验证慢病毒转染效率 |
| 2.4 WesternBlotting检测蛋白表达变化 |
| 2.5 应用嘌呤霉素建立Cofilin过表达及下调的稳定细胞株 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 应用实时定量RT-PCR检测慢病毒转染效果 |
| 3.2 Western Blotting检测慢病毒转染效率 |
| 4 讨论 |
| 实验二、机械牵张应力对过表达COFILIN的成骨细胞内NF-ΚB的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞加载牵张力 |
| 2.2 Western Blotting检测全蛋白表达变化 |
| 2.3 Western Blotting检测核蛋白表达变化 |
| 2.4 荧光素酶报告基因 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 应用Western Blotting检测细胞全蛋白内IkBα,p-IkBα,IKK和p-p65/NF-kB表达 |
| 3.2 应用Western Blotting检测细胞核蛋白内p-p65/NF-kB表达 |
| 3.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4 讨论 |
| 实验三、机械牵张应力对COFILIN下调后的成骨细胞内NF-ΚB的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞加载牵张力 |
| 2.2 Western Blotting检测全蛋白表达变化 |
| 2.3 Western Blotting检测核蛋白表达变化 |
| 2.4 荧光素酶报告基因 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 应用Western Blotting检测细胞全蛋白内IkBα,p-IkBα,IKK和p-p65/NF-kB表达 |
| 3.2 应用Western Blotting检测细胞核蛋白内p-p65/NF-kB表达 |
| 3.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）流体剪切应力对模拟微重力下MG-63细胞骨架系统的影响（论文提纲范文）
| 1 方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 MG-63细胞回转模拟微重力 |
| 1.3 流体剪切应力刺激实验 |
| 1.4 细胞免疫荧光染色 |
| 2 结果 |
| 2.1 形态学变化 |
| 2.2 细胞骨架微丝的改变 |
| 2.3 细胞骨架微管的改变 |
| 3 讨论与结论 |
四、不同重力环境对流体剪切应力诱导成骨细胞环氧合酶-2蛋白表达的影响（论文参考文献）
- [1]TRPM7介导膝骨关节炎中滑膜巨噬细胞M1型极化的机制研究及膝痹宁方的干预作用[D]. 李晓辰. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]流体剪切力介导Piezo1机械敏感性离子通道对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响[D]. 何良志. 兰州大学, 2021(12)
- [3]NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用[D]. 贾梦莹. 新疆医科大学, 2021(08)
- [4]DNA甲基化在运动干预骨质疏松中的作用机制[J]. 刘波,陈祥和,杨康,余慧琳,陆鹏程. 中国组织工程研究, 2021(05)
- [5]麝香乌龙丸对CIA小鼠滑膜S1P代谢情况评价[D]. 张凯淇. 华北理工大学, 2020(02)
- [6]改良脊柱矫正系统的有限元分析研究[D]. 贺祖斌. 右江民族医学院, 2020(03)
- [7]阿司匹林联合脂肪来源间充质干细胞治疗Ⅰ型成骨不全的实验研究[D]. 刘硕. 天津医科大学, 2019(02)
- [8]流体剪切应力下二甲双胍对高糖致损骨细胞的作用研究和机制初探[D]. 孙静. 山东大学, 2018(12)
- [9]机械牵张应力下Cofilin调节NF-κB对成骨细胞成骨效应影响的分子机制研究[D]. 牛茜楠. 中国人民解放军空军军医大学, 2018(04)
- [10]流体剪切应力对模拟微重力下MG-63细胞骨架系统的影响[J]. 杜挺媛,张舒,曹新生,王冰. 航天医学与医学工程, 2012(04)