一、胚胎干细胞在转化生长因子-β1诱导下表达vWF、CD34的研究（论文文献综述）
郭嘉,丁琼桦,刘泽,吕思懿,周泉程,高玉花,白春雨[1]（2022）在《间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用》文中研究指明背景:阐明间充质干细胞来源外泌体的合成、调控作用,对未来外泌体的研究及应用有重要意义。目的:综述不同间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及其在免疫调控中的作用,希望为未来外泌体的研究寻找新的突破点以及无细胞治疗提供思路。方法:检索PubMed数据库、万方数据库、CNKI中国期刊全文数据库收录的相关文献。英文检索词为"stem cell,mesenchymal stem cells,exosmes,immunomodulation,inflammatory mediator,biological characteristics of exosomes,biological characteristics of mesenchymal stem cells,regeneration",中文检索词为"干细胞,间充质干细胞,外泌体,免疫调控,炎性因子,外泌体生物学特性,间充质干细胞生物学特性,再生",最终纳入105篇文献进行归纳总结。结果与结论:间充质干细胞是广泛存在于机体各组织的一种多潜能干细胞,其除了具备干细胞特性外还具有免疫调控作用。间充质干细胞已被大量应用于临床,包括治疗新型冠状病毒肺炎患者,并取得较好的治疗效果。外泌体是一类起源于核内体、直径在40-200 nm的胞外囊泡,间充质干细胞来源外泌体具有与其母源细胞相同的免疫调控功能,例如携带免疫抑制因子、影响巨噬细胞向M2型极化、调节T细胞的分化及抗原提呈等作用。
刘能青[2]（2021）在《不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究》文中指出背景:从各种人体组织和器官中可以分离出被称为间充质基质/干细胞（Mesenchymal stromal/stem cells,MSCs）的多能祖细胞,近10年其研究发展迅速,为细胞治疗和再生医学领域的发展提供了源源不断的动力。研究最广泛的MSCs来源包括骨髓、脂肪、脐带和胎盘等。国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therapy,ISCT）对MSCs制定了最低标准,包括细胞能够粘附在塑料皿上,并表达相应的分化簇（CD）标记（例如CD73、CD90和CD105标记）,并且可以在体外进行成脂,成软骨和成骨分化。MSCs的细胞治疗效能主要体现在分化潜能和免疫调剂能力上,特别是免疫调节能力让其在全身多个系统的炎性疾病中都显示出不俗的疗效。羊水中也能分离出与MSCs生物学特性高度一致的细胞,通常被定义为羊水间充质干细胞（Amniotic fluid mesenchymal stem cells,AFMSCs）或羊水来源干细胞（Amniotic fluid stem cells,AFSCs）。一般认为AFSCs介于胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和MSCs之间的中间阶段细胞,比起传统的MSCs具有更多良好的生物学特,如相比骨髓和脂肪来源的MSCs有更快增殖速度、更广泛的分化潜能、更强的免疫调节能力等。然而AFSCs具有显着的异质性,许多报道表明了AFSCs在细胞形态、分子表型和分化能力等多个方面存在不稳定性。细胞异质性带来的生物学特性的差异,在体外细胞增殖的过程中会进一步把这种差异扩大,进而影响临床细胞治疗效果的稳定性。而AFSCs异质性主要是因为其存在不同的组织器官来源,有研究指出羊水细胞中可以检测出骨髓、皮肤、肾、肝、肺、心等组织器官的特异性标记物。现今为止虽然已经有研究分离了不同组织特异性的AFSCs,但未对其进行深入的生物学特性检测以及临床治疗效能的评估。为此我们拟分离不同组织特异性的AFSCs,从多个角度的评估其生物学特性差异和治疗效能,为解决AFSCs异质性提供可行的思路,为AFSCs临床治疗应用提供更全面深入的理论基础。第一部分不同培养方法分离羊水来源的干细胞及其生物学特性分析目的:建立合适的AFSCs原代和传代培养方案,评估其生物学特性,同时与脐带间充质干细胞进行比较,为后续研究奠定实验基础。方法:1.建立三种培养模式,商品化培养基进行原代和传代培养（AFC）,传统间充质干细胞进行原代和传代培养（MSC）,以及商品化培养基进行原代培养和传统间充质干细胞进行传代培养（AFC-MSC）;2.通过克隆形成实验、CCK-8实验、群体倍增时间检测评估不同培养途径的培养效率;3.流式细胞仪检测细胞表面CD标志物;4.对不同培养途径获得的细胞进行成骨、成脂、成软骨分化,组织特异性染色和分化标志物基因的表达评估分化效果;5.把细胞与激活的外周血单个核细胞（PBMCs）进行共培养,通过CFSE增殖定量分析、增殖标记蛋白的表达及促炎因子的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.三种培养途径均能获得AFSCs细胞,但AFC培养途径效率更高,而MSC培养途径更廉价,AFC-MSC培养效率和成本处于两者之间;2.不同培养途径获得的AFSCs在在CD105的表达上存在差异,但不影响细胞形态、多能性基因的表达、分化潜能和免疫抑制能等主要生物学特性;3.与UCMSCs比较,AFSCs具有更高的成骨和成软骨分化能力,更强的免疫调节能力。结论:三种培养途径均可有效获得的AFSCs,CD105表达的差异不影响其他主要生物学特性,并具有比UCMSCs更强的分化潜能和免疫抑制能力。综合考虑时间和资金成本,选择AFC-MSC培养途径更合适。第二部分分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析目的:分离出不同组织特异性的AFSCs,从细胞形态、增殖能力、分子表型、多能性基因的表达、分化能力、迁移能力和免疫抑制能力等多个方面分析其差异。方法:1.通过机械挑克隆的方法分离出单个细胞形成的克隆并传代;2.对分离的克隆进行组织标记基因的检测,鉴定出不同组织特异性的AFSCs;3.显微镜下观察细胞形态,群体倍增时间分析增殖能力,β-半乳糖苷酶染色及细胞周期调控标志基因分析衰老程度;4.免疫荧光定性分析胚胎干细胞因子的表达,流式细胞仪定量分析细胞抗原决定簇和多能性因子的表达;5.进行成骨、成脂、成软骨分化,通过分化特异性染色的定性、定量分析及检测分化标志物基因的表达来评估分化程度;6.划痕实验、Transwell实验及检测迁移能力和趋化能力的标志基因评估细胞迁移能力;7.把细胞与激活的PBMCs共培养,通过CFSE细胞增殖实验、增殖标记蛋白的表达和促炎因子基因的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.从中孕期羊水分离的AFSCs能表达肺和肾组织特异性标记物,通过分离单细胞克隆并进行鉴定,可以分离出肾特异性AFSCs（AFSCs-K）、肺特异性AFSCs（AFSCs-L）和未知组织特异性AFSCs（AFSCs-X）;2.相比其他两组,AFSCs-K具有更快的增殖速率,更高的CD90、CD105和CD117的表达水平,更好的中胚层三系分化能力和更强的免疫抑制能力。但AFSCs-K具有更强的水平和垂直迁移能力,表达更多的迁移标志物基因,AFSCs-L则表达更多的趋化因子受体。3.分离后的不同组织特异性的AFSCs的各项生物学指标如细胞形态、增殖能力、分子表型、分化潜能等一致性更高,异质性大幅度降低。结论:AFSCs中可以分离出不同组织特异性的细胞,其生物学特性存在差异,总体上AFSCs-X的特性更优。按组织特异性分离后的细胞异质性大幅下降,细胞的各项指标更趋一致。分离不同组织特异性的AFSCs是解决细胞异质性的可行方案第三部分不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能目的:评估不同组织特异性的AFSCs在脓毒血症小鼠模型中的治疗效能。方法:1.使用盲肠穿刺法构建脓毒血症小鼠模型;2.对小鼠进行生存分析,构建生存曲线;3.对血液和腹腔液进行细菌培养,评估AFSCs的抗菌效能;4.Elisa分析血液中促炎因子的表达情况,评估AFSCs的抗炎效能。结果:1.不同组织特异性的AFSCs均能显着改善脓毒血症小鼠的存活率;2.不同组织特异性的AFSCs均能协助机体清除体内细菌,但以AFSCs-X的效果更为显着;3.相比AFSCs-L,AFSCs-K和AFSCs-X更能抑制促炎因子的表达,但两组之间无明显差异。结论:总体上AFSCs能改善脓毒血症生存率,具有抗菌抗炎的效果,其中以AFSCs-X的效果更为明显。
李豫皖[3]（2020）在《Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究》文中指出研究背景/目的:目前在构建骨组织工程中血管形成的作用越来越受到广泛关注,但在构建骨组织工程中,血管形成和成骨分化之间的分子机制目前尚未阐明。人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC）是一种来源于人废弃胎盘表层的多潜能干细胞具有向成骨细胞,成软骨细胞和成脂细胞等多系分化的能力,hAMSCs也具有良好的血管生成能力;Schnurri-3（Shn3）也称为人类免疫缺陷病毒增强结合蛋白-3（human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein 3,HIVEP3）属于BMP/TGF-?的同源物家族。由于Shn3在成骨细胞中的缺失导致Runx2蛋白水平升高进而增强骨形成;骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9）具有显着上调间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）中的各种成骨分化过程中成骨相关因子的表达也能够刺激血管生成相关因子表达。然而,目前Shn3是否能够调节以及如何调节BMP9诱导的hAMSCs在体内外成骨分化和血管形成尚不清楚。基于此,在本课题研究中探讨Shn3是否参与调节BMP9在体内和体外诱导的hAMSCs向成骨分化和血管形成作用的影响及其信号通路和分子机制。方法:（1）胰酶/胶原酶联合消化方法分离并培养hAMSCs,倒置相差显微镜观察其形态改变;使用第3代hAMSCs,通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞表面分子标志物的表达;免疫荧光染色鉴定hAMSCs中波形蛋白和CK-19的表达,检测对第3代hAMSCs向成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化潜能。（2）通过构建重组腺病毒（adenovirus,Ad）外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）（Ad-RFP）转染第3代hAMSCs后,观察转染效率,并使用qRT-PCR检测Shn3基因在细胞中的表达情况;使用碱性磷酸酶染色和生化定量检测第3、5和7天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的早期成骨分化效应;使用茜素红S染色和骨矿化定量观察第14和21天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的晚期骨矿化的作用,并使用qRT-PCR检测第7天时过表达Shn3对BMP9诱导的成骨相关基因Runx2（Runt related transcription factor 2）、骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein,BSP）、I型胶原（Collagen type I,COL-I）、和成骨相关转录因子OSX（Osterix）的mRNA表达水平。（3）通过使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染技术,设BMP9组,Sim-Shn3组,BMP9+Sim-Shn3组和BMP9+Shn3组,分别转染第3代hAMSCs在24h后,将细胞打入裸鼠皮下形成裸鼠体内异位骨化的模型,在4周左右时收取异位骨块样本,并通过Micro-CT（μ-CT）对骨块扫描并行分析,对骨块行固定、包埋和切片染色,使用Masson’s Trichrome三色染色、H&E染色（hematoxylin and eosinstaining）对切片行骨小梁数量和分布进行分析,番红O固绿染色（Safranin O-fast green staining）染色观察异位成骨内软骨形成情况。使用免疫组织化学染色对各实验组异位骨块切片行染色观察,主要观察异位骨块内成骨相关指标包括OCN和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）以及血管形成相关分子如血管生成素-1（Angiopoietin 1,ANGPT1）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在异位骨块中的数量和分布情况。（4）使用细胞免疫组化技术观察过表达或沉默Shn3腺病毒转染细胞后,对BMP9诱导的第3代hAMSCs血管分化指标VEGF的表达及分布。使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,与人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs）在Transwell小室内共培养,其中腺病毒转染的hAMSCs在上层,HUVECs细胞在下层,使用基质胶（Matrigel）铺于板底,观察HUVECs细胞的小管形成能力,简介检测过表达或沉默Shn3对BMP9诱导的hAMSCs血管形成能力。（5）使用电纺聚乳酸-羟基乙酸(poly（lactic-co-glycolic acid,PLGA）共聚物支架材料,将过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）对支架材料的机构和搭载细胞后的细胞长入情况进行观察和分析。通过使用上述支架材料搭载转染腺病毒后的各实验组细胞,在培养48h后,将PLGA-细胞复合物移植入小鼠背部皮下组织内,在5周后,收集小鼠背部皮下移植物样本,并对样本行大体观察移植物在体内的血管长入情况,之后对移植物样本行免疫组织荧光染色,观察其血管性血友病因子（von Willebrand Factor,vWF）在移植物内的表达和分布。（6）使用蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,其成骨分化相关指标OCN、OPN和Runx2的蛋白表达水平;通过使用Western blot技术,检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对BMP/Smads经典的信号（Smad-1/5/8）进行蛋白印迹检测其表达;通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对成骨相关转录因子Runx2和VEGF的直接作用关系。结果:（1）使用胰酶和II型胶原酶联合消化方法可以一次性获得大量形态均一的hAMSCs;通过细胞传代之后到第3代hAMSCs时,hAMSCs可稳定表达波形蛋白,而低表达CK-19;流式细胞检测第3代hAMSCs细胞表面分子标志物符合MSCs鉴定的表型。第3代hAMSCs具有向成骨、成软骨和成脂细胞分化的潜能。（2）重组腺病毒外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Ad-RFP）成功转染第3代hAMSCs后,且qRT-PCR结果显示Shn3在72h左右达到峰值。ALP染色和碱性磷酸酶活性结果显示,在第3、5和7天时,外源性过表达Shn3减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应,而沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应;茜素红S染色和骨矿化定量结果提示在第14和21天时,外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的hAMSCs晚期骨矿化和钙结节的形成;qRT-PCR结果显示在第7天时,外源性过表达Shn3下调了BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关因子包括Runx2、BSP、COL-I和OSX的mRNA表达。（3）在上述Shn3抑制BMP9诱导的hAMSCs体外成骨分化的基础上,进一步研究了Shn3对BMP9诱导的裸鼠皮下异位骨形成的成骨分化的影响。使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染BMP9诱导的第3代hAMSCs细胞后制造的裸鼠异位成骨模型中,大体观察结果和micro-CT结果显示,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组异位成骨的骨体积减小。与其他组相比,BMP9+Sim-Shn3组具有较强的异位成骨能力。Micro-CT的分析结果显示外源性Shn3表达增加了BMP9在hAMSCs中诱导异位骨块的平均骨密度,相反,外源性过表达Shn3降低了BMP9诱导的hAMSCs异位骨形成的平均骨密度。骨组织形态学定量分析显示骨体积/总体积（Bone volume/total volume,BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular number,Tb.N）,骨小梁厚度（Trabecular thickness,Tb.Th）和骨密度（Bone mineral density,BMD）与BMP9组相比,在BMP9+Sim-Shn3组有显着增加,相反,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组的上述参数有不同程度的下降,但骨小梁分离度在各组中无明显差异。组织化学染色结果显示与BMP9组相比,Sim-Shn3可增加了BMP9诱导的异位成骨中小梁骨数量和骨基质的形成。而外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的骨基质形成,同时免疫组化染色结果显示沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的异位骨化中成骨相关因子OCN和OPN以及血管形成相关因子ANGPT1和VEGF的表达,但外源性过表达Shn3基因抑制了此种效应。（4）细胞免疫组化染色结果显示,在第7天是,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs血管分化相关指标VEGF的表达;免疫荧光染色结果显示HUVECs细胞表达内皮粘蛋白（Endomucin,EMCN）、CD31、VEGF和vWF分子的表达;在与HUVECs细胞使用Transwell共培养诱导小管形成实验结果同样显示,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs间接小管形成的能力。（5）在使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜结果显示,细胞在PLGA电纺支架中生长情况良好,多数细胞能够贴壁;PLGA-细胞复合物移植入小鼠皮下的血管形成实验样本大体观察结果显示,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的皮下血管长入,且样本的免疫荧光染色结果提示,较其他各组中,沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的血管形成相关分子vWF的表达。（6）Western blot结果显示,在第7天是,较其他各组,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关指标包括OCN、OPN和Runx2的蛋白水平表达;外源性过表达BMP9增强了Smad1/5/8的磷酸化水平,同时Sim-Shn3显着增强了BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化表达。ChIP分析结果表明,转录因子Runx2能够在BMP9诱导的hAMSC中与VEGF启动子区域相结合。且免疫沉淀和免疫印迹结果表明外源性沉默Shn3的表达能够增强BMP9诱导的细胞中转录因子Runx2对其下游分子VEGF启动子的活性,证明了转录因子Runx2与VEGF分子之间的直接作用关系。结论:（1）人羊膜间充质干细胞具有MSCs的基本表型,具有向多系分化的能力包括成骨、成软骨及成脂细胞的潜能。（2）外源性沉默Shn3基因表达能够增强BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化,而外源性过表达Shn3基因表达则减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化。在外源性沉默Shn3表达后,能够加强BMP9诱导的hAMSCs在体外的血管形成。（3）通过沉默Shn3基因表达可以在体内外促进BMP9诱导的早期和晚期成骨分化以及血管形成的这一过程中,这可能是通过增强BMP/Smads信号来介导,并且Shn3在参与调节BMP9诱导的hAMSCs成骨分化和血管形成的双向效应中,Shn3通过调节关键成骨转录因子Runx2,激活其下游分子VEGF以促进BMP9诱导的hAMSCs的成骨和血管生成方面,Shn3发挥了重要的作用。
张坤[4]（2020）在《人造血干细胞来源的间充质干细胞规模化制备方法研究》文中研究指明造血干细胞（HSCs）的主要来源是经造血干细胞动员的成人外周血以及脐带血,但由于造血干细胞体外大规模扩增非常困难、获取渠道少、复苏活性低、以及CD34+细胞占比低等缺点,导致目前广泛存储的脐带血失去能治疗恶性血液疾病的价值。致使这一宝贵的生物学资源浪费。间充质干细胞（MSCs）来源广泛,且有组织修复及调节免疫等重要功能,是目前临床应用最广泛的干细胞之一,但由于获取方法不同及供体情况的不同,造成间充质干细胞在体外扩增的数量和质量远不能满足不断增长的临床和科研需求。诱导性多能干细胞（iPSCs）技术是将成体细胞或者其他干细胞转入Oct-4、Sox-2、Klf-4和c-myc等四种或其他转录因子,使细胞重编程成为有类似胚胎干细胞生物学特征的多能性干细胞。本文基于诱导性多能干细胞技术对目前广泛存储的造血干细胞进行重编程,诱导其转化为多能干细胞,并大量扩增和最佳细胞系,并将诱导性多能干细胞重新定向分化为间充质干细胞,为临床和科研提供足够数量的间充质干细胞优质来源。本文的研究内容如下:1、将不携带病原体的脐带血中单核细胞以密度梯度离心法进行富集,检测其中的各种细胞群体,并对其形成集落能力进行验证,再将单核细胞进行磁珠分离,获取其中的CD34+细胞,采用全人工培养基进行体外小规模培养扩增,并检测其表面标记物和细胞纯度。采用三种混合游离环状基因载体作为多能性因子载体,将不携带病原体的造血干细胞进行电穿孔转染,并培养得到6株人诱导性多能干细胞,对细胞进行扩增和冻存。并检测每个细胞株形成克隆能力、生长水平、表面标记物表达率、三胚层分化潜能将上述因素进行分析以获得最佳细胞株用于定向分化。2.将最佳细胞株进行全人工培养基诱导,使其定向分化为间充质干细胞。采集同一供体来源的脐带华通氏胶,分离其中的脐带间充质干细胞。将两种来源的间充质干细胞三种分化能力进行验证。滴定流式细胞术抗体以及确定流式细胞术最佳细胞用量后用流式细胞术对两种间充质干细胞表面标记物进行检测。并检测两种间充质干细胞的微生物污染和细胞核染色体。3.对两种来源的间充质干细胞进行大规模培养,并对其同源性进行分析,比较两种细胞的生长能力,并对两种细胞的P3和P13代细胞表面标记物、细胞周期、凋亡水平、外泌体特异性抗体表达率及培养基中多种细胞因子表达率进行检测分析。结果:1.从无病原体污染的脐带血中分离的CD34+细胞量过低,需进行扩增,扩增获取的CD34+细胞总量为2.32*106,CD34表达率达99.4%,细胞纯度高。转染后的细胞于20日后肉眼可见iPSCs集落形成。同时得到的6株细胞均能强表达多能性干细胞表面标记物SSEA4,Oct4,SOX2,细胞生长曲线正常,接种后第三日起快速增殖。从以上数据分析,6株细胞均为iPSCs,其中最优细胞株为细胞株1,将细胞株1大量扩增后注射至免疫缺陷小鼠,小鼠可长出具备三胚层细胞的畸胎瘤。2.采用两步法能使iPSCs定向分化为间充质干细胞。且其和同一供体脐带来源间充质干细胞（UMSCs）均为长梭状,呈旋涡状生长,并能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。通过流式细胞术抗体滴定确定其最佳流式抗体用量为2.5μL,对应最佳细胞数为1*105,以此条件进行流式细胞术鉴定原代细胞,两者均为CD73、CD90、CD105表达率大于95%,CD14、CD34、CD45、CD79a、HLA-DR表达率小于1%,确认两种来源的细胞为间充质干细胞,且两种细胞染色体形态均为正常的23对,无核形异常。3.两种细胞的STR分析显示高度一致,确认其来源相同,无外源基因污染。iMSCs生长能力优于UMSCs。iMSCs传至13代时的细胞表面标记物能正常表达,虽其阳性标记物表达率略有下降,但其阳性标记物CD73、CD90、CD105表达率均高于95%,阴性标记物表达率亦小于1%,可以用于临床治疗。而P13代UMSCs表面标物中CD73、CD90、CD105表达率均低于95%,其阴性标记物均小于1%,无法应用于临床治疗。两种细胞的P3和P13代细胞周期分析和细胞凋亡水平检测则显示两种细胞经过体外传代后凋亡期细胞增加。两种细胞P3代凋亡细胞比率均低于1%。P13代iMSCs凋亡细胞率为6.87%,UMSCs凋亡细胞率为44.41%,iMSCs凋亡晚期细胞和死亡细胞率低于同代次的UMSCs。两种细胞的外泌体特异性蛋白表达率亦随着传代次数增加而降低,同代次iMSCs外泌体特异性表面抗原CD63、CD29、CD73表达率显着高于UMSCs。两种细胞培养基上清液中肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、白细胞介素-6、转化生长因子-β1等4种因子的含量均为iMSCs显着高于UMSCs,随传代次数增加,iMSCs的多种因子分泌量有所下降,而UMSCs外泌因子量则显着下降。仅p3代UMSCs培养基上清中的白细胞介素-8量高于iMSCs,但P13代UMSCs细胞培养基上清液中该因子含量低于iMSCs。iMSCs血管内皮生长因子分泌量显着高于UMSCs,且随传代未见显着下降。结论:本研究构建了对脐带血来源造血干细胞的全人工诱导方案,使之能重编程为诱导性多能干细胞。并对iPSCs进行评价,选择最优细胞株向间充质细胞定向分化。构建了iPSCs向MSCs的全人工定向分化方案,使其能定向分化为iMSCs,且通过该方法获得的iMSCs在体外各代次的生物学特征均优于同供体来源的UMSCs。
孙碧韶[5]（2019）在《尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究》文中进行了进一步梳理背景及目的:化疗药物的临床应用常伴随着一系列的不良反应,造成多器官、多系统损伤,严重影响患者的化疗疗效和预后。在泌尿系统,化疗药物导致的损伤主要表现为急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）和出血性膀胱炎（hemorrhagic cystitis,HC）,具有代表性的化疗药物分别是顺铂和环磷酰胺。目前临床上针对AKI和HC的治疗手段疗效有限,以间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）应用为代表的干细胞技术为其治疗带来了希望,然而MSCs在泌尿系统的应用仍存在障碍。尿源干细胞（urine-derived stem cells,USCs）是相比于MSCs更适用于泌尿系疾病的种子细胞,USCs及USCs分泌的外泌体（exosomes secreted from urine-derived stem cells,USCs-Exo）在多种泌尿系疾病中具有治疗作用,而在化疗药物导致的AKI、HC等泌尿系损伤中的应用尚缺乏探索。本研究旨在探索USCs及USCs-Exo在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用效果,并初步探讨其机制,为临床治疗这类疾病提供新的思路与参考。方法:第一部分:探索USCs在顺铂诱导的大鼠AKI模型中的治疗作用并初步探讨其机制收集6名健康男性的无菌尿液用于USCs的提取及培养。CCK-8实验检测USCs的生长曲线;流式细胞术、免疫荧光检测USCs的表面标志物表达;诱导分化实验检测USCs的多向分化能力;绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）慢病毒转染USCs用于示踪。取30只野生型雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组及治疗组,通过单次腹腔注射顺铂（5 mg/kg）的方式诱导大鼠AKI模型,模型建立后第1天通过尾静脉注射应用2×106 USCs作为治疗。第2、4天各处死1只大鼠,共聚焦显微镜下检测肾组织中GFP标记的USCs,第4天处死所有大鼠,摘眼球取血,取肾组织。血生化检测大鼠血清（serum creatinine,SCr）及尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）的水平;HE及PAS染色观察大鼠肾组织学损伤变化,采用肾小管损伤评分、肾小球损伤计数、PAS阳性面积比评估大鼠肾组织学损伤程度;透射电镜观察大鼠肾脏超微结构的改变;Ki67免疫组化、TUNEL染色观察大鼠肾组织增殖及凋亡的变化;Western Blot实验检测大鼠肾组织TNF-α、IL-6、NF-κB、BCL-2、BAX、cleaved caspase-3的表达变化。采用梯度浓度的顺铂诱导大鼠肾上皮NRK-52E细胞损伤,CCK-8实验检测顺铂的细胞毒性,流式细胞术检测细胞周期,选取合适的浓度诱导后续细胞损伤模型;细胞模型构建后与USCs共培养,CCK-8实验检测损伤细胞增殖活性的变化、流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化。第二部分:探索USCs-Exo在环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎模型中的治疗作用并初步探讨其机制用去除外泌体的胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的培养基培养USCs,2天后收集上清,超速离心法提取USCs-Exo,透射电镜观察外泌体形态;粒径分析检测外泌体粒径分布;Western Blot实验检测外泌体标志蛋白。取45只野生型雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组及治疗组,通过隔日注射1次,共4次的方式腹腔注射80 mg/kg的环磷酰胺诱导小鼠膀胱炎模型。模型建立后的第1天,通过尾静脉注射含100μg总蛋白的USCs-Exo悬液作为治疗,第4天处死所有小鼠取膀胱。HE染色观察膀胱组织学损伤变化,软件测量膀胱上皮厚度及黏膜下层的距离;甲苯胺蓝染色观察膀胱组织肥大细胞浸润变化;Ki67免疫组化观察膀胱黏膜增殖的变化;TUNEL染色观察膀胱黏膜凋亡的变化;扫描电镜观察膀胱黏膜管腔面上皮超微结构改变;Western Blot实验检测膀胱组织中TNF-α、IL-6、IL-10、NOX2、cleaved caspase-3的表达变化;尿动力学实验检测膀胱排尿功能变化。用100 ng/mL的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导人膀胱上皮SV-HUC-1细胞的炎症模型,用PKH67染色的USCs-Exo与SV-HUC-1共培养,激光共聚焦显微镜下观察LPS诱导的SV-HUC-1对USCs-Exo的吸收;CCK-8实验检测SV-HUC-1细胞增殖活性的变化,划痕实验检测SV-HUC-1细胞迁移能力的变化。提取USCs-Exo及相应USCs中的RNA,small RNA测序探讨可能的机制。结果:1.我们提取的USCs呈指数生长,可快速增殖;表达与MSCs类似的表面标志物CD44、CD73、CD105、CD133;不表达造血干细胞表面标志物CD31、CD34、CD45;表达胚胎干细胞表面标志物SSEA4;表达肾周细胞表面标志物CD146、PDGFRB、NG2;能向平滑肌和上皮细胞分化。在USCs治疗后,大鼠血清BUN、SCr水平显着降低;肾小管损伤评分、肾小球损伤计数、PAS阳性面积比明显降低;大鼠肾脏超微结构明显改善;肾小管上皮细胞增殖增加、凋亡减少;在第2、第4天均可在肾组织中发现GFP标记的USCs;TNF-α、IL-6、NF-κB、BAX、cleaved caspase-3的表达水平明显降低,BCL-2的表达水平明显升高。梯度浓度的顺铂均可导致NRK-52E细胞增殖活性降低、细胞周期阻滞。选择10μM、20μM诱导体外模型,与USCs共培养后,诱导的NRK-52E细胞增殖活性显着升高、细胞周期阻滞改善,细胞凋亡率显着下降。2.我们提取的USCs-Exo电镜下呈典型的“杯盘状”形态;粒径分布在80200 nm;表达外泌体标志蛋白CD9、CD63。在USCs-Exo治疗后,小鼠膀胱黏膜上皮厚度减少、黏膜下层距离明显降低;肥大细胞浸润明显减少;黏膜上皮增殖率降低、凋亡率减少;膀胱上皮管腔面的超微结构明显改善;TNF-α、IL-6、cleaved caspase-3及NOX2的表达水平均下降、而IL-10的表达水平升高;小鼠排尿间隔延长、最大排尿压下降。LPS诱导的SV-HUC-1细胞可吸收USCs-Exo,与USCs-Exo共培养后,增殖活性增强、迁移能力增强。small RNA测序提示USCs-Exo中的microRNA可能是其发挥治疗作用的机制所在。结论:1.USCs可通过减轻炎症反应,抑制肾小管上皮细胞凋亡,促进肾小管上皮细胞增殖,从而在体内和体外减轻顺铂诱导的AKI大鼠模型的肾损伤;2.USCs对AKI大鼠模型的治疗作用可能是通过USCs直接向肾组织归巢分化或通过旁分泌方式发挥作用;3.USCs-Exo可通过减轻炎症反应及氧化应激、抑制膀胱上皮细胞的病理性增生及凋亡、及促进膀胱上皮细胞的迁移及分化,从而减轻环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎,促进其排尿功能的恢复;4.USCs-Exo对膀胱炎小鼠模型的治疗作用很可能与其所含有的microRNA有关。
郭洋[6]（2019）在《人经血干细胞携带溶瘤腺病毒用于结直肠癌的治疗研究》文中研究表明结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是一类常见的消化系统恶性肿瘤,严重威胁人类健康。传统的放化疗并不能显着提高患者的生存率,因而探索一种新型有效的结直肠癌治疗手段至关重要,近些年溶瘤病毒的肿瘤治疗应运而生。溶瘤病毒可选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞,同时激活机体的抗肿瘤免疫反应;然而,直接通过静脉注射溶瘤病毒会引起抗病毒免疫反应而降低其作用效果,因而选择合适的载体将溶瘤病毒运输至肿瘤部位是实现安全、高效、精准治疗的关键。本研究我们利用人经血干细胞（Human menstrual blood-derived stem cells,Men SCs）运输溶瘤腺病毒,探索其作为载体的靶向运输能力和结合溶瘤腺病毒对CRC的治疗效果。MenSCs是近年来新发现的一种成体干细胞,与其他间充质干细胞相比,具有来源丰富、采集方便无创、体外扩增迅速、无伦理道德争议等优势。本研究中,我们首先从女性志愿者经血样本中分离获取经血源干细胞,并对其进行传代培养和相关表面标记的鉴定,进而探索其作为病毒运输载体的可行性和结合溶瘤病毒治疗CRC的有效性。为了优化溶瘤病毒对Men SCs的感染效率,我们构建了一种新型嵌合型的溶瘤腺病毒CRAd5/F11,将11型腺病毒的纤毛嵌入5型腺病毒结构中,这种嵌合型病毒主要通过识别细胞表面受体CD46感染细胞;通过一定滴度的CRAd5/F11感染后,Men SCs的细胞活性及其免疫表型并未受到明显影响,且Men SCs-CRAd5/F11细胞株在体内外迁移实验中均能够靶向肿瘤组织或细胞,证实了Men SCs作为溶瘤病毒靶向运输载体的可行性;我们进一步探索了Men SCs-CRAd5/F11细胞株对结直肠癌的治疗潜能,体外研究中,我们利用CCK8和细胞凋亡等体外实验检测了Men SCs-CRAd5/F11对肿瘤细胞的杀伤作用,最后在体内结直肠癌小鼠模型中通过不同方式对Men SCs-CRAd5/F11进行移植,一定时间后观察到小鼠肿瘤的生长明显受到抑制,由此证实利用Men SCs运载CRAd5/F11治疗结直肠癌的有效性。综上所述,Men SCs是一种充满潜能的细胞载体,其能够将嵌合型溶瘤病毒CRAd5/F11安全有效地运输至肿瘤部位并发挥抗肿瘤作用,利用Men SCs装载溶瘤病毒可实现对结直肠癌的病毒靶向治疗,为临床结直肠癌及其他肿瘤的治疗提供了理论依据。
高利平[7]（2017）在《构建病人个体化组织工程血管补片修复动脉缺损的研究》文中研究指明研究背景及目的:先天性心脏病是儿童心血管外科最为常见的疾病,其中许多心血管畸形需要用补片纠正。目前临床常用的补片材料包括人工合成材料和生物材料,然而,这些材料具有抗原性,或在体内没有生长能力,并且材料表面因没有内皮细胞覆盖而导致血栓形成及内膜增生等并发症。本研究旨在以人源性主动脉脱细胞基质支架复合病人自身骨髓干细胞构建组织工程血管补片,并使之内皮化,评估该补片对动脉缺损的修复作用。方法及结果:我们将手术切除的的成人主动脉组织脱细胞得到主动脉脱细胞基质支架,以先天性心脏病患儿骨髓CD34+祖细胞为种子细胞,构建出病人个体化组织工程血管补片。在脱去细胞成分及DNA后,主动脉脱细胞基质支架保留了天然细胞外基质成分,包括胶原,弹性纤维,纤粘蛋白,层粘蛋白和硫酸化糖胺聚糖等。拉力测试显示主动脉脱细胞基质支架与天然主动脉具有相似的机械特征。体外实验显示主动脉脱细胞基质支架促进了CD34+祖细胞的粘附,存活及增殖。在不加入任何生长因子的情况下,CD34+祖细胞在支架材料上培养21天后可分化为血管内皮样细胞,表现为CD31、VWF、VE-cadherin、ICAM-2等内皮标记物蛋白表达明显增加,而CD133和CD34蛋白表达减少,且CD31、VWF和e NOS的m RNA表达增加。CD34+祖细胞分化为内皮样细胞导致主动脉脱细胞基质支架表面的内皮化。蛋白质谱发现主动脉脱细胞基质支架内含多种促进血管生成成分,包括核心蛋白聚糖,原纤蛋白,衰老关键蛋白抗原,半乳凝聚素,细胞粘合素x,玻连蛋白,纤连蛋白,层连蛋白,网蛋白,纤维蛋白原,基底膜聚糖及胶原等,而仅含有血小板反应蛋白一种抗血管生成成分。另外,蛋白芯片结果提示主动脉脱细胞基质可促进CD34+祖细胞分泌多种促进自身向内皮细胞分化的因子,包括angiogenin、GM-CSF和leptin等。我们进一步发现,主动脉脱细胞基质可诱导CD34+祖细胞表达Notch的配体DLL1;而用γ-secretase抑制剂DAPT抑制Notch通路后,CD34+祖细胞表达内皮标志物CD31明显减少。将此血管补片移植到裸大鼠腹主动脉可修补腹主动脉缺损,移植28天后取出补片,免疫荧光结果显示血管补片表面有内皮细胞层覆盖,HE染色表明血管补片内部有宿主细胞迁入,排列整齐;胶原增生不明显,弹性纤维完整,在形态上接近于正常动脉组织。结论:我们首次利用人源性主动脉脱细胞基质材料和患者自身CD34+骨髓祖细胞,构建出病人个体化组织工程血管补片。在体外,此动脉脱细胞基质促进了CD34+祖细胞向内皮细胞分化,可能与脱细胞基质中的组成成分,以及相关成分作用于CD34+祖细胞后促进其分泌多种细胞因子有关;在此过程中,Notch通路可能促进了CD34+祖细胞的分化。裸鼠移植实验表明该新型血管补片在体内可有效修复动脉缺损,提示具有较大的临床应用潜力。
刘旭倩[8]（2016）在《人牙龈成纤维细胞构建组织工程化血管的实验研究》文中指出第一部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究目的:体外分离培养人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGFs）诱导分化为血管内皮细胞（vascular endothelial cell,VEC）。探讨人牙龈成纤维细胞（HGFs）在体外分化为血管内皮细胞（VEC）的潜能。方法:1牙龈组织的获取和分离正常人牙龈组织取自河北医科大学口腔医院口腔颌面外科,患者下颌阻生齿拔除术。牙龈组织手术切取后带回实验室,在无菌条件下分离牙龈上皮及结缔组织,留取牙龈结缔组织进行细胞培养。2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的培养培养液选用含15%胎牛血清的L-DMEM。牙龈结缔组织剪成1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养。培养的细胞达到80%融合后,进行细胞传代培养。3人牙龈成纤维细胞（HGFs）的鉴定3.1流式细胞仪检测人牙龈成纤维细胞（HGFs）,选择波形蛋白（vimentin）抗体和CD31抗体鉴定成纤维细胞和血管内皮细胞。3.2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的RT-PCR鉴定TRIzol法提取成纤维细胞的总RNA;以分光光度计测定细胞总RNA的纯度及浓度;应用反转录试剂盒RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA;以适量反转录所得的cDNA为模版,在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增;将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳,然后置于凝胶图像分析系统进行吸光度扫描,以GAPDH作为内参照校正,用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。3.3人牙龈成纤维细胞（hgfs）免疫细胞化学染色采用鼠抗人vimentin单克隆抗体、鼠抗人iii型胶原单克隆抗体,通过免疫细胞化学染色法检测vimentin蛋白和iii型胶原蛋白在人牙龈成纤维细胞中的表达与分布。3.4人牙龈成纤维细胞（hgfs）免疫荧光染色采用兔抗人s-100a4抗体和鼠抗人肌动蛋白α（α-sma）抗体,通过免疫荧光染色法检测s-100a4蛋白和α-sma蛋白在人牙龈成纤维细胞hgfs中的表达与分布。4生长曲线的测定采用mtt法测定第16代人牙龈成纤维细胞（hgfs）17天的od490nm处的吸光值。5内皮细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞（hgfs）中的表达采用vimentin,血管生成素受体2（tie2）抗体和血管生长因子受体2（vegfr2）抗体,通过westernblot半定量vimentin蛋白,tie2蛋白和vegfr2蛋白在不同vegf165浓度组和不同诱导周期组中的表达量。real-timepcr相对定量法检测不同vegf165浓度组和不同诱导周期组中vimentin基因,tie2基因,血管生成素2（ang2）基因的mrna相对表达量。6诱导过程中的形态学观察倒置显微镜观察8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞（hgfs）0,7,14,21,28,35,42和50天时的形态学变化。7诱导后血管内皮样细胞的鉴定7.1免疫细胞化学染色8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞35天后,采用鼠抗人cd34单克隆抗体、鼠抗人cd31单克隆抗体,通过免疫细胞化学染色法检测cd34蛋白和cd31蛋白在诱导后血管内皮样细胞的表达与分布。7.2免疫荧光染色8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞35天后,采用血管性假血友病因子（vwf）抗体和上皮钙粘附分子（e-cadherin）抗体,通过免疫荧光染色检测vwf蛋白和e-cadherin蛋白在诱导后血管内皮样细胞的表达与分布。7.3rt-pcr鉴定诱导后血管内皮样细胞中tie2基因的mrna相对表达量。7.4经8ng/mlvegf诱导35天后,通过透射电镜观察诱导后血管内皮样细胞的超微结构。8流式细胞仪测定诱导细胞转化率采用cd34抗体和cd31抗体,通过流式细胞仪检测诱导后血管内皮细胞中cd34和cd31的阳性表达率,以评估人牙龈成纤维细胞（hgfs）分化为血管内皮细胞（vec）的转化率。9成管能力测试检测诱导后血管内皮细胞的功能将诱导前后细胞接种于24孔板的matrigel基质胶中,olympusix71倒置显微镜下观察管状排列结构和完整度并计数管状结构的数量,对诱导后血管内皮细胞（vec）的功能进行评估。结果:1人牙龈成纤维细胞（hgfs）的基本生长情况细胞多数呈长梭形,细胞核较大,呈圆形或椭圆形。原代培养以组织块为中心向周围辐射生长,传代培养的细胞生长状态好,34天即可生长达90%100%。2人牙龈成纤维细胞（hgfs）的鉴定结果2.1流式细胞仪检测人牙龈成纤维细胞（hgfs）表面抗原vimentin和cd31表达结果培养的成纤维样细胞表面抗原vimentin表达阳性,阳性率为（97.13±0.62）%;而表面抗原cd31表达率仅为（8.64±1.55）%。两者比较有统计学差异（p<0.05）。2.2细胞rt-pcr鉴定结果细胞rt-pcr结果显示人牙龈成纤维细胞（hgfs）特异性表达vimentin,s-100a4和α-sma。然而,tie2在细胞中不表达。2.3细胞的免疫细胞化学鉴定结果鼠抗人vimentin单克隆抗体和鼠抗人iii型胶原单克隆抗体染色结果显示细胞呈阳性反应。2.4细胞的免疫荧光染色鉴定结果兔抗人s-100a4多克隆抗体和鼠抗人α-sma单克隆抗体荧光染色结果显示细胞分别呈绿色荧光和红色荧光表达。3人牙龈成纤维细胞（hgfs）生长曲线测定结果结果显示第2代或第3代人牙龈成纤维细胞（hgfs）的对数生长期比其余代次细胞增殖水平显着升高（p<0.05）,而第2代或第3代细胞的对数生长期细胞增殖水平无统计学差异（p>0.05）。4内皮细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞（hgfs）中的表达westernblot结果显示,8ng/mlvegf165诱导时tie2蛋白和vegfr2的相对表达量最高。real-timepcr结果显示,经8ng/mlvegf165诱导时tie2基因和ang2基因的mrna相对表达量达到最高。westernblot结果显示,诱导周期达到35天时tie2蛋白和vegfr2蛋白的相对表达含量最高。real-timepcr结果显示,诱导周期达到35天时tie2和ang2基因的mrna相对表达量最高。5vegf165对诱导后细胞形态学的影响人牙龈成纤维细胞（hgfs）经8ng/mlvegf165诱导714天,大部分细胞仍然呈现丛状或束状排列;1421天时,细胞逐渐排列形成多边形上皮细胞样结构;2128天时,细胞逐渐出现融合成簇现象,逐渐形成鹅卵石样或铺路石样的生长排列形式;2835天时,绝大多数细胞呈现铺路石样的生长形式以及形成血管腔样结构。6免疫细胞化学染色对诱导后细胞的鉴定鼠抗人cd34单克隆抗体和鼠抗人cd31单克隆抗体染色结果显示细胞呈阳性反应。7rt-pcr鉴定诱导后细胞tie2基因的表达rt-pcr结果显示,与对照组相比,tie2基因在诱导后细胞中显着表达。8免疫荧光染色对诱导后细胞的鉴定兔抗人vwf抗体和兔抗人e-cadherin抗体荧光染色结果显示细胞分别呈红色荧光表达。9诱导后细胞超微结构的观察透射电镜观察显示,细胞表面呈现微绒毛结构,细胞胞浆内出现溶酶体结构及内皮细胞特有的weibel-palad小体（w-p小体）。10流式细胞仪检测分析人牙龈成纤维细胞（hgfs）向血管内皮细胞（vec）分化的转分化率诱导后细胞组cd34和cd31细胞表型阳性率与对照组相比,差异有显着性,具有统计学意义（p<0.05）。11成管能力测试实验比较诱导前后细胞形成小管的能力诱导形成的细胞组在matrigel基质胶中24小时呈现管状样结构,与对照组相比,诱导组成管数目显着增高,具有统计学差异（p<0.05）。第二部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管平滑肌细胞的研究目的:体外分离培养人牙龈成纤维细胞（humangingivalfibroblasts,hgfs）并诱导分化为血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell,vsmc）,证实人牙龈成纤维细胞（hgfs）具有在体外分化为血管平滑肌细胞（vsmc）的潜能。方法:1人牙龈组织的获取,分离和细胞的培养同第一部分。2人牙龈成纤维细胞（hgfs）的鉴定2.1人牙龈成纤维细胞（hgfs）的rt-pcr鉴定同第一部分。2.2人牙龈成纤维细胞（hgfs）免疫细胞化学染色同第一部分。2.3人牙龈成纤维细胞（hgfs）免疫荧光染色同第一部分。3生长曲线的测定同第一部分。4平滑肌细胞相关标记物在诱导分化中的人牙龈成纤维细胞（hgfs）中的表达采用波形蛋白（vimentin）,肌动蛋白α（α-sma）和肌球蛋白（sm-mhc）抗体,通过westernblot半定量vimentin蛋白,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白在不同pdgf-bb浓度组和不同诱导周期组中的表达量。real-timepcr相对定量法检测不同pdgf-bb浓度组和不同诱导周期组中vimentin基因,α-sma基因,sm-mhc基因,calponin1（cnn1）基因和平滑肌22α（sm22α）基因的mrna相对表达量。5诱导过程中细胞的形态学观察倒置显微镜观察10ng/mlpdgf-bb（含2ng/mltgf-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（hgfs）0,7,14,21,28和35天时的形态学变化。6诱导后细胞的鉴定6.110ng/mlpdgf-bb（含2ng/mltgf-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（hgfs）28天后,采用兔抗人α-sma抗体和鼠抗人sm-mhc抗体,通过免疫细胞化学染色法检测α-sma蛋白和sm-mhc蛋白在诱导后血管平滑肌样细胞的表达与分布。6.2采用cnn1抗体和sm22α抗体,通过免疫荧光染色检测cnn1蛋白和sm22α蛋白在诱导后血管平滑肌样细胞的表达与分布。6.3rt-pcr鉴定诱导后细胞中α-sma基因和sm-mhc基因的表达量。6.4经10ng/mlpdgf-bb（含2ng/mltgf-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（hgfs）28天后,通过透射电镜观察诱导后细胞的超微结构。结果:1人牙龈成纤维细胞（hgfs）的基本生长情况:结果同第一部分。2人牙龈成纤维细胞（hgfs）的鉴定2.1细胞rt-pcr的鉴定细胞特异性表达vimentin基因和s-100a4基因,弱表达α-sma基因,不表达sm-mhc基因。2.2细胞的免疫细胞化学鉴定:结果同第一部分。2.3细胞的免疫荧光染色鉴定:结果同第一部分。3人牙龈成纤维细胞（hgfs）生长曲线的测定结果:结果同第一部分。4平滑肌细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞（hgfs）中的表达westernblot结果显示,诱导浓度达到10ng/mlpdgf-bb时,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白的相对表达量最大;诱导周期达到28天时,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白的相对表达含量最高。real-timepcr结果显示,当经10ng/mlpdgf-bb诱导时α-sma基因,sm-mhc基因,cnn1基因和sm22α基因的mrna相对表达量最高;诱导周期达到28天时,α-sma基因,sm-mhc基因,cnn1基因,sm22α基因的mrna相对表达量最高。5诱导过程中细胞的形态学观察人牙龈成纤维细胞（hgfs）经10ng/mlpdgf-bb（含2ng/mltgf-β1）诱导07天,大部分细胞仍然呈现丛状;721天时,部分细胞呈现凋亡状态,细胞数量呈现一段时间的减少状态,但仍然为丛状排列;2128天时,细胞伸出伪足并相互连接,在密集与稀疏处相互交错略呈“峰谷”状,可与成纤维细胞相鉴别;2835天,绝大多数细胞已呈典型的“峰谷”状生长排列方式。6免疫细胞化学染色对诱导后细胞的鉴定结果显示,诱导后细胞兔抗人α-sma抗体呈强阳性反应,鼠抗人sm-mhc抗体呈阳性反应。对照组α-sma仍呈阳性反应,sm-mhc单克隆抗体呈阴性反应。7免疫荧光染色对诱导后细胞的鉴定结果显示,诱导后细胞sm22α抗体和cnn1抗体分别经rhodamine和fitc荧光染色呈阳性反应,胞浆分别呈红色荧光和绿色荧光表达。8细胞rt-pcr检测诱导后细胞α-sma和sm-mhc基因的表达诱导组α-sma基因mrna的相对含量明显高于未诱导组,具有统计学差异（p<0.05）;诱导组sm-mhc基因mrna的相对含量明显高于未诱导组,具有统计学差异（p<0.05）。9诱导后细胞超微结构观察结果透射电镜观察可见胞浆中有少量高尔基复合体,线粒体,粗面内质网,大量粗细不一的肌丝样结构或肌丝束以及电子密度较高的密体样结构等。第三部分兔脱细胞血管基质联合类人Ι型胶原合成支架材料的生物学特性及其细胞相容性的研究目的:应用冻干技术将类人i型胶原蛋白（human-likecollageni,hlc-i）合成高分子材料与兔脱细胞血管基质（acellularvascularmatrix,acvm）支架材料复合,制备acvm-0.25%hlc-i血管支架材料,探讨其生物学特性及与细胞的相容性。方法:1acvm基质的制备称量家兔体重,注射麻醉并结扎预取动脉分支,迅速切取血管,浸入生理盐水中,冲洗管腔后浸入含有1%苯扎溴铵的pbs复合液中60分钟,冲洗后0.1%胰蛋白酶处理6小时,冲洗后移入1%tritonx-100中72小时,制备的acvm基质浸入pbs中保存于4?c冰箱。2acvm基质he染色,观察脱细胞情况。3acvm基质masson染色,观察脱细胞情况及acvm基质中的胶原成分。4acvm与hlc-i的复合丙烯酸预处理acvm基质,紫外灯辐射30分钟,蒸馏水洗净数次后放入真空干燥器中;预处理acvm浸入到碳化二亚胺水溶性中,4oc冰箱中1小时;将不同浓度hlc-i（0.10mg/ml,0.25mg/ml,0.50mg/ml,0.75mg/ml,1.00mg/ml）复合于acvm基质表面12小时;清洗后acvm-hlc-i支架减压干燥,4oc保存备用。5人牙龈成纤维细胞（hgfs）的培养扩增及鉴定,实验方法同第一部分。6mtt法测定hlc-i与acvm的交联的最佳浓度在不同浓度acvm-hlc-i支架上接种人牙龈成纤维细胞（hgfs）,分别培养1,4,7天时测量各孔od490nm的吸光值,以确定hlc-i与acvm基质交联的最佳浓度。7支架的吸水性测试实验分为两组,acvm-0.25%hlc-i支架组和acvm支架组,室温条件下,分别称量两组材料浸入pbs前后的重量,干燥状态下重量标记为w0,浸湿24小时后重量标记为w1。支架材料的吸水量百分比计算公式:w1-w0/w0×100%。8支架的力学性能测定采用zwick/roellz020型万能力学实验机来检测标本的拉伸强度,断裂强度和断裂伸长率。实验分为未脱细胞的兔血管组,单纯acvm支架组和acvm-0.25%hlc-i支架组进行检测,记录应力和应变,绘制出应力-应变曲线。9支架的压力爆破实验实验分为未脱细胞的兔血管组,单纯acvm支架组和acvm-0.25%hlc-i支架组。用注满生理盐水的压力枪进行压力爆破实验。10扫描电镜观察支架表面结构a组为未脱细胞的血管组织;b组为acvm支架;c组为acvm-0.25%hlc-i支架,分别观察支架的侧面和内面。11cck-8试剂盒检测acvm-0.25%hlc-i支架的体外细胞毒性待测样品分为acvm-0.25%hlc-i支架组和单纯acvm支架组,铺于96孔板中,与100μl细胞悬液培养24,48和72小时,用cck-8试剂盒进行检测,酶标仪测定各组在450nm处的吸光度,通过计算细胞毒性活力（%）,即相对生长率来评价支架的体外细胞毒性。结果:1acvm基质大体观察结果acvm基质呈乳白色,管腔塌陷,管壁变薄,弹性消失并可折叠。2he染色观察acvm基质脱细胞程度结果显示,内膜层呈现透明状,无蓝染细胞核及细胞碎片等残留物,中膜层已经无平滑肌细胞结构,未见蓝染细胞核及细胞碎片等物质,整个管壁变薄,纤维结构稀疏。3masson染色观察acvm基质胶原成分及脱细胞程度结果显示,acvm基质中血管内皮细胞,血管平滑肌细胞和大部分肌纤维等成分脱落,大部分为染成绿色的胶原纤维和少量染成红色的肌纤维,但纤维结构稀疏。4人牙龈成纤维细胞（humangingivalfibroblasts,hgfs）的培养、传代及鉴定结果结果同第一部分。5mtt法测定hlc-i与acvm支架的最佳复合浓度细胞接种于不同浓度hlc-i复合的acvm支架后经1,4和7天培养后,mtt实验结果显示,0.25%hlc-i复合于acvm支架上更有利于细胞的增殖,即为acvm-0.25%hlc-i支架。6acvm-0.25%hlc-i的吸水性测试结果结果显示,acvm-0.25%hlc-i支架与acvm支架相比,吸水能力无差别,二者无统计学差异（p>0.05）。7acvm-0.25%hlc-i支架材料的生物力学测定结果acvm-0.25%hlc-i支架的应力和应变均大于acvm支架,而与未脱细胞兔血管无统计学差异。acvm-0.25%hlc-i支架的抗拉伸能力与未处理的天然兔血管更加接近,而acvm支架的抗拉伸能力最差。acvm-0.25%hlc-i支架的断裂强度和断裂伸长率均与未处理的天然兔血管相近,而acvm支架断裂强度与未处理的天然兔血管相比有所降低,其断裂伸长率却有所增加。8acvm-0.25%hlc-i支架材料的压力爆破实验结果acvm-0.25%hlc-i支架的爆破压力大于单纯acvm基质的爆破压力（p<0.05）;而acvm-0.25%hlc-i支架与未经脱细胞处理兔血管的爆破压力无差别（p>0.05）。9扫描电镜观察acvm-0.25%hlc-i支架表面结构的超微结构经0.25%的hlc-i复合后,扫描电镜可见acvm-0.25%hlc-i支架与acvm基质相比,纤维更加致密,内膜层,中膜层和外膜层分界不清,各层均未见细胞分布。10acvm-0.25%hlc-i支架的体外细胞毒性测试结果acvm-0.25%hlc-i支架和acvm支架的相对生长率（rgr）在24,48和72小时时各时间点均在75%以上,acvm-0.25%hlc-i支架和acvm支架的体外细胞毒性评估均合格。随着时间的增加（24,48和72小时）,细胞在两种支架材料上的增殖情况为逐渐上升的趋势。第四部分体外构建组织工程化血管及裸鼠体内动态强化的研究目的:采用分层方式将人牙龈成纤维细胞（humangingivalfibroblasts,hgfs）诱导分化形成的血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell,vsmc）和血管内皮细胞（vascularendothelialcell,vec）种植于acvm-0.25%hlc-i支架上构建初级组织工程化血管,再将初级组织工程化血管埋植于裸鼠皮下进行动物体内动态强化实验,探讨人牙龈成纤维细胞（hgfs）联合acvm-0.25%hlc-i支架构建组织工程化血管的可行性及裸鼠体内作用力对构建的组织工程化血管的影响。方法:1acvm-0.25%hlc-i支架材料的制备与处理,实验方法同第三部分。2acvm-0.25%hlc-i支架材料的消毒处理3eduapollo488标记诱导形成的血管平滑肌细胞（vsmc）和血管内皮细胞（vec）及鉴定标记率4eduapollo488标记血管平滑肌细胞（vsmc）并种植于acvm-0.25%hlc-i支架采用多次沉淀法将eduapollo488标记的诱导血管平滑肌细胞（vsmc）（1×106/ml）种植于acvm-0.25%hlc-i支架上,连续培养7天。5dapi标记诱导形成的血管内皮细胞（vec）及荧光显微镜下观察标记率6凝胶法种植诱导的血管内皮细胞（vec）将dapi标记的血管内皮细胞（vec）与matrigel基质按照4:1的比例混合制备成vecs-matrigel凝胶,均匀涂抹于种植有vsmcs-acvm-0.25%hlc-i支架材料的表面,置于37?c,5%co2的培养箱内,12小时后加入含15%fbs的1640:l-dmem=1:1的培养液,连续培养3天。7种子细胞种植支架后he染色观察8种子细胞种植支架后免疫组化染色兔抗人肌动蛋白（α-sma）抗体或鼠抗人肌球蛋白（sm-mhc）抗体特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架上的血管平滑肌细胞（vsmc）。鼠抗人cd34抗体和鼠抗人cd31抗体特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面生长的血管内皮细胞（vec）。9种子细胞种植支架后免疫荧光染色9.1免疫荧光单标鉴定calponin1（cnn1）蛋白和平滑肌22α（sm22α）蛋白特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面及内部生长的血管平滑肌细胞（vsmc）,荧光二抗采用fitc;血管性假血友病因子（vwf）蛋白和上皮钙粘附分子（e-cadherin）蛋白特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面生长的血管内皮细胞（vec）,荧光二抗采用rhodamine,激光扫描共聚焦显微镜采集图像。9.2免疫荧光双标鉴定一抗采用兔抗人sm22α抗体和鼠抗人vwf抗体或鼠抗人cnn1抗体和兔抗人e-cadherin抗体;一抗采用兔抗人α-sma抗体和鼠抗人cd34抗体或鼠抗人sm-mhc抗体和兔抗人cd31抗体;荧光二抗采用山羊抗鼠rhodamine和山羊抗兔fitc或山羊抗兔rodamine和山羊抗鼠fitc进行免疫荧光双标。同时标记acvm-0.25%hlc-i支架上的两种细胞。10扫描电镜观察11裸鼠体内动态强化实验将单纯acvm-0.25%hlc-i支架组和构建的血管组植入裸鼠皮下。分别于术后第3、6、9周再次麻醉动物,取出植入皮下的组织进行固定,行组织学观察,荧光染色观察和压力承受实验测定。11.1组织学观察11.2eduapollo488和dapi荧光染色示踪细胞11.3压力承受实验测定实验分为裸鼠体内埋植的单纯acvm-0.25%hlc-i支架组,构建的血管组和正常血管组,用注满生理盐水的压力枪进行压力爆破实验。结果:1细胞示踪标记率结果eduapollo488标记的诱导血管平滑肌细胞（vsmc）和血管内皮细胞（vec）在荧光显微镜下可见90%以上的细胞被标记上;经dapi标记的诱导血管内皮细胞（vec）在荧光显微镜下可见90%以上的细胞被标记上。2体外构建组织工程化血管2.1he染色观察单独种植诱导的血管平滑肌细胞（vsmc）于acvm-0.25%hlc-i支架时,可见细胞在支架材料内部及表面均匀生长;单独种植诱导的血管内皮细胞（vec）于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架表面时,细胞单层排列分布于支架表面;种植两种细胞于acvm-0.25%hlc-i支架时可见内层为诱导血管内皮细胞（vec）层,中间为matrigel-vsmcs层,最外层为纤维支架层。2.2免疫组化染色结果单独种植诱导的血管平滑肌细胞（vsmc）于acvm-0.25%hlc-i支架时,细胞呈α-sma和sm-mhc抗原阳性反应。单独种植诱导的血管内皮细胞（vec）于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架时,细胞呈cd34和cd31抗原阳性反应。2.3免疫荧光染色结果2.3.1免疫荧光单标结果单独种植诱导的血管平滑肌细胞（vsmc）于acvm-0.25%hlc-i支架时,cnn1和sm22α抗原阳性反应,支架内部和表面的细胞被fitc染成绿色荧光,细胞核被dapi染成蓝色。单独种植诱导的血管内皮细胞（vec）于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架时,vwf和e-cadherin抗原阳性反应,支架表面的细胞被rhodamine染成红色荧光,细胞核被dapi染成蓝色。2.3.2免疫荧光双标结果分层种植于acvm-0.25%hlc-i支架的种子细胞中,支架材料内部的细胞sm22α,cnn1,α-sma或sm-mhc抗原阳性反应,胞浆fitc呈绿色荧光表达,表面的部分细胞vwf,e-cadherin,cd34或cd31抗原阳性反应,胞浆rhodamine呈红色荧光表达,细胞核均被dapi染成蓝色。2.4扫描电镜观察结果结果显示,横断面尚可见双层细胞结构,内表面可见诱导形成的血管内皮细胞（vec）均匀分布且与支架具有良好的生物相容性,细胞与细胞之间呈铺路石样结构。3裸鼠体内动态强化实验结果3.1标本大体观察3周时,单纯支架组和细胞支架组均位于裸鼠的皮下,周围有极薄的裸鼠组织包裹,管腔坍塌,管腔中间有少量裸鼠组织长入;6周时,管型结构完整,裸鼠组织长入,使得管壁相对增厚,管腔中间有裸鼠组织长入;9周时,管型结构仍然完整,周围和中间的裸鼠组织包裹增厚更明显。3.2组织学观察he染色可见,3周时,单纯支架组管壁结构清晰,周围有少量纤维组织包绕和少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁中有大量种植细胞和少量裸鼠细胞长入,周围有少量纤维组织包绕和大量炎细胞浸润。6周时,单纯支架组有少量降解,管壁中有裸鼠细胞长入,周围少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁中有大量细胞,结构清晰,周围有纤维组织包绕,炎细胞浸润减少。9周时,单纯支架组逐渐降解,周围有大量纤维结缔组织包绕和少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁仍然十分清晰,管壁中有大量细胞,大部分来源于诱导形成的血管平滑肌细胞（vsmc）和血管内皮细胞（vec）,少数来源于裸鼠细胞的长入,周围少量纤维组织包绕,炎细胞浸润几乎看不到。3.3eduapollo488和dapi荧光染色示踪细胞结果实验组裸鼠皮下植入培养9周后,acvm-0.25%hlc-i支架上诱导血管平滑肌细胞（vsmc）被eduapollo488标记呈绿色荧光,诱导血管内皮细胞（vec）被eduapollo488标记呈绿色荧光,同时被dapi标记呈蓝色荧光,证实这些细胞来源于之前种植于支架的种子细胞。3.4压力承受实验测定结果acvm-0.25%hlc-i支架组与组织工程化血管组相比,具有统计学差异（p<0.05）;组织工程化血管组与正常血管组相比,无统计学差异（p>0.05）结论:1人牙龈成纤维细胞（hgfs）能在体外诱导分化为血管内皮细胞（vec）。2人牙龈成纤维细胞（hgfs）能在体外诱导分化为血管平滑肌细胞（vsmc）。3类人i型胶原蛋白（hlc-i）与兔脱细胞血管基质（acvm）联合制备的acvm-0.25%hlc-i支架材料具备充分的促进细胞粘附,细胞增殖和细胞迁移能力以及良好的机械性和生物力学性能。4人牙龈成纤维细胞（hgfs）诱导分化为血管平滑肌细胞（vsmc）和血管内皮细胞（vec）,分层种植于acvm-0.25%hlc-i支架材料上,体外能够成功构建组织工程化血管组织。5裸鼠体内强化实验证实,由人牙龈成纤维细胞（hgfs）诱导分化的血管内皮细胞（vec）和血管平滑肌细胞（vsmc）联合acvm-0.25%hlc-i支架材料,在裸鼠体内生长9周,构建的组织工程化血管组织形态完好。
陆阳[9]（2013）在《局部高密度扩增骨髓内成血管类祖细胞及相关机制研究》文中认为干细胞体外扩增和干性维持是本领域的研究热点和难点,已知体内干细胞特性维持与自我更新依靠其所处的微环境,其中干细胞之间,以及与周围细胞的接触与信息交换起着重要的作用,而传统体外干细胞培养方法破坏了细胞间的接触与信息交换,降低了扩增效率。我们提出了局部高密度细胞接种的设想,通过高密度接种骨髓细胞的方法来增加细胞之间的相互接触,达到扩增骨髓中成血管类祖细胞的目的。目的本研究旨在通过局部高密度培养增加细胞-细胞间接触,进而达到扩增骨髓中成血管类祖细胞的目的,并通过基因芯片分析,定量PCR等手段,发现并验证与高密度培养相关的特异性分子,阐明高密度培养扩增并维持成血管类祖细胞特性的可能机制。该研究将解决骨髓成血管类祖细胞体外扩增难题,并为研究细胞-细胞接触建立重要的体外研究模型。方法我们从wistar大鼠的股骨与胫骨中取出骨髓,进行原代培养。原代培养的细胞消化后,以2×105/cm2为密度点状接种直径10cm培养皿,均匀分布6点接种,每皿细胞总量9×105,以相同数量细胞均匀接种于相同大小培养皿作为普通密度培养对照组。在培养15天后,我们通过流式细胞术对传统密度已经局部高密度培养出的骨髓细胞进行表型的鉴定,并在体外与体内验证了局部高密度培养得到的细胞与传统密度培养得到的细胞在血管再生能力上的差异。结果流式细胞分析结果显示与传统密度相比,局部高密度培养的骨髓细胞与原代细胞的表型更为接近,高表达CD14（（18）（20）（13）（22）（4））,CD133（（19）（22）（13）（20）（4））,CD45（（19）（24）（13）（24）（4））,KDR（（18）（17）（13）（24）（4））,CD144（（18）（19）（13）（20）（4））,CD31（（18）（21）（4））与CD34（（22）（13）（20）（4））这些与造血和成血管类祖细胞密切相关的表面标志,显示了局部高密度培养的骨髓细胞可能具有很强的血管再生能力。我们通过在matrigel上的成管实验证明了局部高密度培养的骨髓细胞在体外具有更加良好的血管形成能力,结果显示传统密度形成的分支节点数为7.2个,而局部高密度形成的分支节点数为29.8个。我们通过对下肢缺血裸鼠的细胞治疗来证明了局部高密度扩增细胞具有更好的潜在治疗价值。结果显示下肢缺血裸鼠治疗三周后,局部高密度治疗组能够更好的改善缺血裸鼠的预后:出现下肢坏死的比例为30%,作为对照PBS组坏死率为100%,传统密度组坏死率为90%。下肢血流改变反映了同样的趋势:高密度治疗组3周后患/健血流比为0.82,而PBS组与传统密度组患/健血流比分别为0.4与0.53。我们检测了缺血下肢肌肉内的血管密度,结果显示高密度治疗组的血管密度为776.9/mm2,而PBS组与传统密度组血管密度分别为400/mm2与423.4/mm2。最后我们通过基因芯片以及定量PCR的方法初步探讨了局部高密度扩增骨髓内成血管类祖细胞的可能机制。实验结果显示局部高密度扩增的细胞高表达整合素类相关表面分子,整合素类分子与细胞接触密切相关,同时也可以影响细胞的成血管能力,因此可能整合素类分子的上调在局部高密度扩增成血管类祖细胞中起到了重要的作用。另外我们发现了在局部高密度培养体系,一些与血管再生密切相关的生长因子无论在基因还是在蛋白上的表达均明显高于传统密度培养体系,这提示生长因子的差异也可能是局部高密度扩增成血管干细胞的可能机制之一。结论局部高密度培养大鼠骨髓细胞可以扩增出骨髓中的成血管类祖细胞,这些细胞具有很强的体内外形成血管的能力并具有很好的治疗缺血性疾病的价值。这些成血管类祖细胞在局部高密度体系内的扩增可能与整合素相关分子的上调,细胞外基质相关分子的上调以及成血管类生长因子的高表达有着密切的联系。
赵娴[10]（2013）在《自体外周血EPCs与BMSCs联合PDPBB构建微血管化生物骨》文中研究表明[研究背景及目的]在整形外科临床工作中,骨缺损严重导致患者外观畸形、功能毁损。中国是拥有世界上最多人口的国家,每年因先天畸形、各类创伤、疾病、交通意外、肿瘤手术等造成的各类骨组织缺损的患者大概在300万例以上。随着人口老龄化范围的扩大,骨缺损患者的数量正在以每年10%的数率增长。随着组织工程的蓬勃发展和研究的不断深入,各种类型的组织工程骨开始逐渐应用于骨缺损修复,但因种子细胞功能单一、多采用异体种子细胞等,导致组织工程骨因血管化不良、排异反应等引发坏死、吸收,不仅使骨缺损修复失败,坏死物更可对机体产生不良损伤,严重阻碍了组织工程骨进入临床研究及运用。因此,构建组织相容性好,无排异反应,血管化良好的组织工程骨,是组织工程骨进行临床修复应用的关键。本课题组拟采用来源于自体的具有优异新生血管及管腔形成能力的自体外周血内皮祖细胞（EPCs）与自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）构建联合培养种子细胞,并将该种子细胞复合于课题组制备的脱蛋白生物骨构建自体组织工程生物骨,对BMSCs对EPCs的血管化促进作用、组织工程骨的成骨作用提供体外、体内连续性动态监控。为构建可血管化、无排异组织工程骨的临床应用提供系统化技术支持。[方法]（1）抽取新西兰大耳白兔外周血密度梯度离心法加贴壁法提取纯化自体外周血内皮祖细胞,取第三代细胞进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133vWF表面标志；（2）麻醉状态下抽取新西兰大耳白兔骨髓液,密度梯度离心法加贴壁法提取纯化自体骨髓间充质干细胞,取第三代细胞进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD29、CD34、CD90表面标志；（3）取骨髓间充质干细胞与外周血内皮祖细胞按照：外周血内皮祖细胞、2：1、1：2、1：1、骨髓间充质干细胞的浓度共同培养；使用倒置显微镜对各组细胞的形态变化进行观察；各组细胞的生长增殖由Wst-1法检测并描绘出曲线,比较各组细胞增殖率；（4）细胞联合培养体系构建后第3天、7天、14天时将最佳比例自体联合培养细胞（外周血EPCs及BMSCs均来源与同一实验动物）、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞进行碱性磷酸酶染色及和茜素红钙染色；倒置显微镜下观察碱性磷酸酶和骨钙素分泌情况；并采用ALP试剂盒及OC试剂盒定量测定各组细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量：（5）于联合培养3、7、14天分别提取最佳比例自体联合培养细胞、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞组总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测成骨和血管化基因的表达,包括VEGF.Osteonectin.Osteopotin和Collagen Type I:（6）采用新鲜猪椎骨脱钙、脱细胞处理后制备成部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白包被制成脱蛋白生物骨,运用扫描电镜、液体置换法检测该生物骨的孔隙率及孔径；骨髓间充质干细胞和外周血内皮祖细胞接种部分脱蛋白生物骨片,Wst-1法检测吸光度,检测最佳比例自体联合培养细胞、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞组细胞在脱蛋白生物骨上的生长情况,确定最佳移植时间,运用扫描电镜对各个细胞组在PDPBB粘附、增殖情况进行观测；（7）抽取外周血及骨髓的健康新西兰大耳白兔12只,于其右上肢、双下肢分别进行自体工程骨回植（PDPBB+外周血内皮祖细胞组；PDPBB+骨髓间充质干细胞；PDPBB+最佳比例自体联合培养细胞组：）,分别将组织工程骨植于新西兰大耳白兔股肌袋内（自体联合培养细胞组植回原取材动物体内）；硬组织切片免疫组化染色检测CD34、CD105、ZO-1分析新骨微血管化情况。[结果]（1）抽取的外周血用密度梯度离心法、贴壁培养法提取纯化并进行扩增,可获得高纯度的EPCs,第三代外周血EPCs抗原CD34、CD133、vWF免疫荧光鉴定均为阳性；（2）骨髓液用密度梯度离心法、贴壁培养法提取纯化并进行细胞扩增,可获得大量高纯度的BMSCs,第三代BMSCs抗原CD29、CD90免疫荧光染色鉴定均为阳性,CD34为阴性；（3）体外联合培养细胞1：2组3天许多细胞间出现突触相互连接,自体联合培养细胞各比例组部分细胞融合成团块状,各组混合细胞Wst-1检测吸光度逐渐升高,骨髓间充质干细胞、2：1、1：2、1：1联合培养细胞体系、外周血内皮祖细胞组均在13天时达到高峰,联合培养细胞组1：2浓度吸光度最高；随后各浓度组细胞吸光度持续平台期,差异有统计学意义；（4）体外培养第3天时ALP染色：外周血内皮祖细胞组及单纯骨髓间充质干细胞组呈阴性反应,自体联合培养细胞组部分细胞阳性：7天时外周血内皮祖细胞组ALP染色仍未见阳性细胞,自体联合培养细胞组可见阳性细胞增多,有小片状细胞阳性,单纯骨髓间充质干细胞组可见散在颜色较淡的阳性细胞；14天时外周血内皮祖细胞组ALP染色仍未见阳性细胞,联合培养细胞组可见阳性细胞增多成大片状,颜色明显加深,单纯骨髓间充质干细胞组可见散在阳性细胞,颜色仍较淡；各组ALP检测量随时间延长逐渐增高,各时间自体联合培养细胞组ALP最高；外周血内皮祖细胞组碱性磷酸酶没有明显变化；ALP含量在其它各组与自体联合培养细胞之间进行两两比较均有统计学意义（P<0.01）。（5）体外培养第3天时茜素红骨钙检测自体联合培养细胞组部分细胞阳性；7天时茜素红染色外周血内皮祖细胞组仍呈阴性反应,自体联合培养细胞组可见阳性细胞增多,有小片状细胞阳性,单纯骨髓间充质干细胞组可见颜色较淡的散在阳性细胞；14天时外周血内皮祖细胞组茜素红染色仍呈阴性,联合培养细胞组可见阳性细胞细胞增多成大片状,颜色明显加深,单纯骨髓间充质干细胞组可见多量散在阳性细胞,；随时间延长,各组OC检测量逐渐增高,14天时检测量最高,OC含量在其它各组与自体联合培养细胞之间进行两两比较均有统计学意义（P<0.01）。（6）实时荧光定量PCR检测显示3天、7天、14天时自体联合培养体系VEGF、 Osteonectin、Osteopotin及Collagen Type I的mRNA表达均逐渐上升,单纯骨髓间充质干细胞组恒定表达少量Osteonectin、Osteopotin及Collagen Type I,VEGF表达量较低,单纯EPCs组VEGF表达升高。其中自体联合培养体系四种因子表达量最高。（7）电镜观察：由猪椎骨制备部分脱蛋白骨由大量的羟基磷灰石纤维编织而成,孔隙分布均匀,纤维蛋白包被的脱蛋白生物骨表面见大量颗粒状、片状纤维蛋白,自体联合培养细胞组的细胞在骨支架上粘附生长较好,并形成团块状分布,产生大量胶原蛋白丝,单纯骨髓间充质干细胞及单纯内皮祖细胞在骨支架上粘附生长较少；（8）通过Wst-1检测显示,各细胞组细胞在脱蛋白生物骨上吸光度逐渐增高,在第12天达到峰值,其中自体联合培养细胞组明显升高,各细胞组之间差异有统计学意义（P<0.01）：（9）植入新西兰大耳白兔股肌袋内的组织工程生物骨血管化情况：采用免疫组化染色检测CD105、CD34、及ZO-1的表达,结果显示第2周肉芽组织已经长入组织工程骨孔隙内,联合培养细胞组于2周、4周、8周可见阳性细胞数逐渐增多,可见薄壁的微血管形成,血管腔内可见红细胞；EPCs组见少量阳性细胞及微血管形成,单纯骨髓干细胞组阳性细胞数少,且未见明显血管管腔样结构；各时间段CD105、CD34、及ZO-1阳性表达于联合细胞组均高于单纯BMSCs组及EPCs组,差异具有统计学意义（P<0.01）；结论：（1）兔外周血经密度梯度离心分离及贴壁法提纯即可获得纯度较高的EPCs,无需特殊诱导；（2）兔骨髓液经密度梯度离心法,并结合贴壁法扩增进行分离纯化获得的BMSCs,经免疫荧光染色鉴定为较高纯度的细胞,可在联合培养实验中应用；（3）外周血内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞体外培养下,细胞促进彼此的增殖；在体外,外周血内皮祖细胞能诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,而骨髓间充质干细胞可促进外周血内皮祖细胞微血管化,1：2比例自体联合细胞培养可以达到最好效果；（4）体外,骨髓间充质干细胞能促进外周血内皮祖细胞血管化的能力,自体联合细胞培养体系血管化能力最强；（5）外周血EPCs可促进BMSCs在骨支架上的附着和生长,自体联合培养细胞在PDPBB支架材料上的增殖优于单纯骨髓间充质干细胞和单纯外周血内皮祖细胞,12天为最佳移植时机：（6）在动物活体内,自体联合培养细胞组微血管化能力最强,形成微血管管腔,外周血内皮祖细胞能增强组织工程骨血管化能力,形成新生血管,建立微循环,改善组织工程骨的血液供应；（7）外周血内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合培养体系复合PDPBB构建的组织工程骨是骨缺损修复的良好微血管化生物活性材料,具有组织相容性好,微血管化好等符合正常骨组织生理特性的优点,适合于临床实验及临床应用。
二、胚胎干细胞在转化生长因子-β1诱导下表达vWF、CD34的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎干细胞在转化生长因子-β1诱导下表达vWF、CD34的研究（论文提纲范文）
（1）间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3 数据提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 间充质干细胞 |
| 2.2 外泌体的生成与分泌 |
| 2.3 外泌体的生物学特性及调控作用 |
| 2.4 间充质干细胞来源外泌体的作用 |
| 2.4.1 对固有免疫的调节作用 |
| 2.4.2 影响适应性免疫 |
| 2.4.3 再生功能 |
| 2.5间充质干细胞来源外泌体的应用研究 |
| 2.5.1 间充质干细胞来源外泌体与移植物抗宿主反应 |
| 2.5.2间充质干细胞来源外泌体与系统性红斑狼疮 |
| 2.5.3 间充质干细胞来源外泌体与心血管疾病 |
| 2.5.4 间充质干细胞来源外泌体与神经性疾病 |
| 2.5.5 外泌体的载体作用 |
| 3 总结与展望Summary and prospects |
（2）不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究（论文提纲范文）
| 缩略词英中文索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言总论 |
| 第一部分 不同培养方法分离羊水来源的干细胞及分析其生物学特性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基于分化潜能和免疫调节特性的羊水来源干细胞的治疗潜力 |
| 参考文献 |
| 附录 研究技术路线图 |
| 硕士研究生在读期间发表的论文及个人奖励 |
| 致谢 |
（3）Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 羊膜间充质干细胞分离、提取与鉴定及其多向分化潜能的实验研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Shn3对BMP9 诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成的作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成中的信号机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:成骨分化和血管形成中分子的偶联机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间的主要学术成果 |
（4）人造血干细胞来源的间充质干细胞规模化制备方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写索引 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 干细胞简介 |
| 1.1.1 干细胞的定义和分类 |
| 1.1.2 诱导性多能干细胞 |
| 1.1.3 间充质干细胞 |
| 1.1.4 造血干细胞 |
| 1.1.5 造血干细胞向间充质干细胞的定向分化方案的现状 |
| 1.2 干细胞的检测与鉴定 |
| 1.2.1 干细胞的增殖能力检测 |
| 1.2.2 流式细胞术检测 |
| 1.2.2.1 造血干细胞的表面标记物 |
| 1.2.2.2 人诱导性多能干细胞的表面标记物 |
| 1.2.2.3 人间充质干细胞的表面标记物 |
| 1.2.3 免疫荧光染色检测 |
| 1.2.4 细胞分化能力 |
| 1.2.5 细胞外源性污染检测 |
| 1.3 间充质干细胞的外泌体和旁分泌研究 |
| 1.3.1 间充质干细胞外泌体的分离方法 |
| 1.3.2 间充质干细胞外泌体的鉴定和检测方法 |
| 1.3.3 间充质干细胞旁分泌因子 |
| 第2章 诱导性多能干细胞系的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与载体 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 用于重编程的造血干细胞获取 |
| 2.2.1.1 脐带血的病原体检测 |
| 2.2.1.2 脐带血单核细胞的富集 |
| 2.2.1.3 单脐带血核细胞表面标记物的鉴定和分群 |
| 2.2.1.4 单核细胞的体外成集落水平验证 |
| 2.2.1.5 造血干细胞的纯化 |
| 2.2.1.6 造血干细胞的培养 |
| 2.2.1.7 造血干细胞的流式细胞术鉴定 |
| 2.2.2 重编程造血干细胞制备诱导性多能干细胞 |
| 2.2.2.1 游离重编程载体转染造血干细胞 |
| 2.2.2.2 诱导性多能干细胞培养 |
| 2.2.2.3 选取诱导性多能干细胞克隆和扩增 |
| 2.2.2.4 诱导性多能干细胞收集和冻存 |
| 2.2.3 诱导性多能干细胞的鉴定和检测 |
| 2.2.3.1 诱导性多能干细胞的细胞生长水平比较 |
| 2.2.3.2 诱导性多能干细胞的表面标记物鉴定 |
| 2.2.3.3 诱导性多能干细胞的畸胎瘤试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 脐带血的病原体检测结果 |
| 2.3.2 单核细胞的表面标记物鉴定和分群、计数 |
| 2.3.3 单核细胞的体外集落形成试验结果 |
| 2.3.4 造血干细胞的纯化后培养和流式细胞术检测其表面标记物 |
| 2.3.5 造血干细胞转染后细胞状态 |
| 2.3.6 诱导性多能干细胞的集落形成能力 |
| 2.3.7 诱导性多能干细胞表面标记物检测结果 |
| 2.3.8 诱导性多能干细胞生长水平 |
| 2.3.9 诱导性多能干细胞的畸胎瘤试验 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 两种间充质干细胞的制备和鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用生物样本和外检 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的制备 |
| 3.2.1.1 诱导性多能干细胞的复苏培养 |
| 3.2.1.2 分步诱导多能性干细胞定向分化为间充质干细胞 |
| 3.2.1.3 诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的扩增培养 |
| 3.2.2 同一供体来源的脐带间充质干细胞的制备 |
| 3.2.2.1 脐带来源间充质干细胞的分离 |
| 3.2.2.2 脐带来源间充质干细胞的扩增培养 |
| 3.2.3 两种间充质干细胞的鉴定和检测 |
| 3.2.3.1 细胞细菌、真菌污染检测 |
| 3.2.3.2 细胞支原体污染检测 |
| 3.2.3.3 细胞内毒素污染检测 |
| 3.2.3.4 两种来源间充质干细胞分化潜能检测 |
| 3.2.3.5 间充质干细胞流式细胞术检测抗体滴定试验 |
| 3.2.3.6 间充质干细胞流式细胞术检测最佳细胞数的确定 |
| 3.2.3.7 流式细胞术检测细胞表面标记物 |
| 3.2.3.8 检测两种来源细胞的染色体核型 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 诱导性多能干细胞细胞复苏扩增 |
| 3.3.2 更换定向分化培养基后的细胞状态 |
| 3.3.3 两种来源的间充质干细胞的细胞形态学比较 |
| 3.3.4 两种来源干细胞的细菌、真菌污染检测 |
| 3.3.5 细胞支原体污染检定 |
| 3.3.6 细胞内毒素污染检定 |
| 3.3.7 细胞分化能力检定 |
| 3.3.8 流式细胞术检测间充质干细胞最佳抗体用量 |
| 3.3.9 流式细胞术检测间充质干细胞最佳细胞数 |
| 3.3.10 间充质干细胞表面标记物检定 |
| 3.3.11 细胞染色体核型分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 脐带来源间充质干细胞与诱导性多能干细胞来源间充质干细胞的生物学特征比较 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 样本送检 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 两种细胞短串联重复序列分析比较 |
| 4.2.2 两种细胞生长能力比较 |
| 4.2.3 P3和P13代两种细胞表面标记物检测比较 |
| 4.2.4 P3和P13代两种细胞细胞周期比较 |
| 4.2.5 P3和P13代两种细胞凋亡水平比较 |
| 4.2.6 P3和P13代两种细胞外泌体分离 |
| 4.2.7 P3和P13代两种细胞外泌体表面标记物流式检测 |
| 4.2.8 两种细胞P3和P13 代细胞上清液中各种常见因子表达量检测 |
| 4.2.8.1 HGF含量检测 |
| 4.2.8.2 IGF-1 含量检测 |
| 4.2.8.3 IL-6 含量检测 |
| 4.2.8.4 IL-8 含量检测 |
| 4.2.8.5 VEGF含量检测 |
| 4.2.8.6 TGF-β1 含量检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 细胞STR分析 |
| 4.3.2 细胞生长水平比较 |
| 4.3.3 细胞表面标记物比较 |
| 4.3.4 细胞周期比较 |
| 4.3.5 细胞凋亡水平比较 |
| 4.3.6 细胞外泌体特异性标记物比较 |
| 4.3.7 细胞培养基上清液中各种常见因子表达量检测 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（5）尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 USCs在顺铂诱导的大鼠AKI模型中的治疗作用及机制初探 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 USCs-Exo在环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎模型中的治疗作用及机制初探 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 尿源干细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）人经血干细胞携带溶瘤腺病毒用于结直肠癌的治疗研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 经血干细胞的分离培养及鉴定 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和试剂 |
| 1.2.1 MenSCs的来源 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 MenSCs的分离培养 |
| 1.3.2 细胞冻存和复苏 |
| 1.3.3 MenSCs细胞表面标记分子鉴定 |
| 1.3.4 MenSCs诱导分化实验 |
| 1.3.5 免疫荧光检测MenSCs表面干性分子 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 MenSCs的分离培养 |
| 1.4.2 MenSCs细胞成骨成脂分化结果 |
| 1.4.3 MenSCs细胞表面标记分子流式鉴定结果 |
| 1.4.4 MenSCs表面干性标记的表达 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二部分 MenSCs-CRAd5/F11 细胞株的构建及功能鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要设备 |
| 2.2.3 MenSCs及肿瘤细胞系来源 |
| 2.2.4 结直肠癌细胞的培养 |
| 2.2.5 溶瘤腺病毒CRAd5/F11的构建及分离纯化 |
| 2.2.6 动物实验 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Western Blot检测MenSCs表面受体蛋白表达 |
| 2.3.2 CRAd5/F11 感染MenSCs |
| 2.3.3 电镜的检测CRAd5/F11 |
| 2.3.4 CRAd5/F11对MenSCs毒性作用的检测 |
| 2.3.5 CRAd5/F11 感染后MenSCs上清中病毒颗粒数的检测 |
| 2.3.6 MenSCs-CRAd5/F11 细胞表面标记分子鉴定 |
| 2.3.7 MenSCs-CRAd5/F11 对肿瘤细胞的趋化实验 |
| 2.3.8 MenSCs-CRAd5/F11 在肿瘤小鼠体内的迁移实验 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 MenSCs表面受体蛋白的表达 |
| 2.4.2 溶瘤病毒对MenSCs感染效率的检测 |
| 2.4.3 MenSCs细胞内病毒颗粒的电镜检测 |
| 2.4.4 CRAd5/F11对MenSCs的毒性作用 |
| 2.4.5 感染CRAd5/F11的MenSCs上清中病毒颗粒数检测 |
| 2.4.6 MenSCs-CRAd5/F11 表面标记的表达情况 |
| 2.4.7 MenSCs-CRAd5/F11 体外对肿瘤细胞的趋化作用 |
| 2.4.8 MenSCs-CRAd5/F11 在体内对肿瘤组织的归巢作用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 CRAd5/F11 依赖细胞受体CD46 感染MenSCs |
| 2.5.2 CRAd5/F11对MenSCs和肿瘤细胞的毒性作用 |
| 2.5.3 MenSCs-CRAd5/F11 对肿瘤的靶向迁移 |
| 2.6 结论 |
| 第三部分 MenSCs运载CRAd5-F11 治疗结直肠癌的体内外实验研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要设备 |
| 3.2.3 MenSCs及肿瘤细胞系来源 |
| 3.2.4 溶瘤腺病毒CRAd5/F11及CRAd5/F11-TIS的构建 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 WB检测肿瘤细胞表面腺病毒结合受体的表达 |
| 3.3.2 CRAd5/F11对肿瘤细胞毒性作用的检测 |
| 3.3.3 运载CRAd5/F11的MenSCs对肿瘤细胞的抑制实验 |
| 3.3.4 荷瘤小鼠肿瘤模型的建立及肿块大小的测量 |
| 3.3.5 MenSCs的移植 |
| 3.3.6 组织标本的制备 |
| 3.3.7 肿瘤组织的免疫组化分析 |
| 3.3.8 肿瘤组织细胞凋亡的TUNEL检测 |
| 3.3.9 MenSCs-CRAd5/F11-TIS对肿瘤的作用 |
| 3.3.10 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 肿瘤细胞表面腺病毒受体蛋白的表达 |
| 3.4.2 溶瘤病毒对肿瘤细胞具有杀伤作用 |
| 3.4.3 携带CRAd5/F11的MenSCs对肿瘤细胞的杀伤作用 |
| 3.4.4 病毒抗体血清对溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的影响 |
| 3.4.5 体内动物实验操作及时间安排示意图 |
| 3.4.6 MenSCs-CRAd5/F11 移植后抑制肿瘤的生长 |
| 3.4.7 肿瘤组织免疫组化相关蛋白的检测 |
| 3.4.8 MenSCs-CRAd5/F11 诱导肿瘤组织凋亡 |
| 3.4.9 MenSCs-CRAd5/F11-TIS在体内对肿瘤的抑制作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 MenSCs运载CRAd5/F11 对肿瘤的治疗 |
| 3.5.2 溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤和抑制机制 |
| 3.5.3 溶瘤病毒结合基因治疗 |
| 3.5.4 溶瘤病毒CRAd5/F11从MenSCs胞内释放的机制探讨 |
| 3.5.5 MenSCs结合溶瘤病毒治疗肿瘤的安全性问题 |
| 3.6 结论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞的基本特性与疾病治疗的应用 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
（7）构建病人个体化组织工程血管补片修复动脉缺损的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一章 人主动脉脱细胞基质的制备及血管补片的构建 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法与步骤 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 人主动脉脱细胞基质支架的生化特征 |
| 1.3.2 主动脉脱细胞基质的机械特征 |
| 1.3.3 主动脉脱细胞基质支架的再细胞化 |
| 1.3.4 主动脉脱细胞基质支架促进 CD34+祖细胞增殖 |
| 1.3.5 体外CD34+祖细胞分化为内皮样细胞 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 血管脱细胞基质支架促进内皮祖细胞向内皮细胞分化的初步研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2.2 实验方法及步骤 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SDS-PAGE分离主动脉脱细胞基质蛋白 |
| 2.3.2 质谱鉴定出的人主动脉细胞外基质蛋白 |
| 2.3.3 蛋白芯片检测CD34+祖细胞分泌的细胞因子 |
| 2.3.4 CD34+祖细胞分化为内皮样细胞的信号通路 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 血管补片修复大鼠腹主动脉缺损的实验研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法及步骤 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 裸大鼠腹主动脉血管补片的移植 |
| 3.3.2 形态学染色 |
| 3.3.3 移植物的内皮标志物染色 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（8）人牙龈成纤维细胞构建组织工程化血管的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管平滑肌细胞的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 兔脱细胞血管基质联合类人 Ι 型胶原合成支架材料的生物学特性及其细胞相容性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 体外构建组织工程化血管及裸鼠体内动态强化的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 组织工程化血管内皮细胞种子细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 组织工程化血管支架材料的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）局部高密度扩增骨髓内成血管类祖细胞及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| Abbreviation |
| 绪论 |
| 第一部分 大鼠骨髓局部高密度培养体系的建立 |
| 第二部分 局部高密度培养骨髓细胞的表型鉴定 |
| 第三部分 局部高密度培养骨髓细胞的功能鉴定 |
| 第四部分 局部高密度扩增成血管类祖细胞的机制研究 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 主要参考文献 |
| 学术论文和科研成果 |
| 致谢 |
（10）自体外周血EPCs与BMSCs联合PDPBB构建微血管化生物骨（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验一 自体外周血来源内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞的制备 |
| 1、前言 |
| 2、材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 外周血内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合培养体系复合PDPBB建立生物骨 |
| 1、 前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 联合培养体系中外周血EPCs对BMSCs成骨作用的研究 |
| 1、前言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 外周血EPCs及BMSCs联合培养体系体内、外微血管化能力的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章及获奖情况 |
| 致谢 |
四、胚胎干细胞在转化生长因子-β1诱导下表达vWF、CD34的研究（论文参考文献）
- [1]间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用[J]. 郭嘉,丁琼桦,刘泽,吕思懿,周泉程,高玉花,白春雨. 中国组织工程研究, 2022(07)
- [2]不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究[D]. 刘能青. 广州医科大学, 2021
- [3]Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究[D]. 李豫皖. 重庆医科大学, 2020(01)
- [4]人造血干细胞来源的间充质干细胞规模化制备方法研究[D]. 张坤. 重庆理工大学, 2020(08)
- [5]尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究[D]. 孙碧韶. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [6]人经血干细胞携带溶瘤腺病毒用于结直肠癌的治疗研究[D]. 郭洋. 浙江大学, 2019(01)
- [7]构建病人个体化组织工程血管补片修复动脉缺损的研究[D]. 高利平. 上海交通大学, 2017(05)
- [8]人牙龈成纤维细胞构建组织工程化血管的实验研究[D]. 刘旭倩. 河北医科大学, 2016(05)
- [9]局部高密度扩增骨髓内成血管类祖细胞及相关机制研究[D]. 陆阳. 上海交通大学, 2013(05)
- [10]自体外周血EPCs与BMSCs联合PDPBB构建微血管化生物骨[D]. 赵娴. 昆明医科大学, 2013(12)
标签：干细胞论文; 内皮细胞论文; 转化生长因子-β论文; 诱导多能干细胞论文; 胚胎干细胞论文;