一、禽类免疫抑制/干扰（论文文献综述）
姜皓[1]（2021）在《REV-SNV对SPF雏鸡RLRs信号通路相关MiRNAs及其靶基因表达的影响》文中提出禽网状内皮组织增生症（RE）是由禽网状内皮组织增生症病毒（REV）引起的禽类传染性致瘤性疾病。REV主要感染鸡、鸭、鹅、火鸡等禽类,导致生长迟缓、免疫抑制和肿瘤等病症。先天性免疫通路作为抵御入侵病原微生物的第一道屏障,在宿主抗病毒反应中发挥着重要作用,而细胞质中最重要的识别病毒RNA的模式识别受体（PRRs）是RIG-I样受体家族（RLRs）。前期我们利用REV-SNV人工感染1日龄SPF鸡的动物疾病模型,收集7dpi、14dpi、21dpi的脾脏样品进行高通量测序,对m RNA和miRNA表达谱数据进行整合分析后发现,RLRs受体信号通路中涉及的CASP10基因和MAPK10基因不仅显着差异表达,且其表达分别与gga-miR-1618-5p和gga-miR-222b-5p存在明显的负调控关系。为了进一步掌握RLRs通路相关的上述两个miRNA和基因在REV-SNV感染中的表达规律,我们利用前期动物试验所收集的组织样品,选择同一感染日龄（7dpi,14dpi,21dpi）法氏囊和不同感染日龄（28dpi,35dpi,42dpi）脾脏为研究对象,与对照组相比,法氏囊结果显示:在7dpi时,gga-miR-222b-5p表达极显着下调,MAPK10表达无显着差异,gga-miR-1618-5p表达极显着下调,CASP10表达极显着上调;在14dpi时,gga-miR-222b-5p表达无显着差异,MAPK10表达极显着上调,gga-miR-1618-5p表达无显着差异,CASP10表达极显着上调;在21dpi时,gga-miR-222b-5p表达显着下调,MAPK10表达无显着差异,gga-miR-1618-5p表达无显着差异,CASP10表达极显着上调。而脾脏组织的结果表明:在28dpi时,gga-miR-222b-5p表达极显着上调,MAPK10表达无显着差异,gga-miR-1618-5p表达极显着下调,CASP10表达极显着上调;在35dpi时,gga-miR-222b-5p表达极显着上调,MAPK10表达极显着下调,gga-miR-1618-5p表达无显着差异,CASP10表达极显着上调;在42dpi时,gga-miR-222b-5p、MAPK10和CASP10表达无显着差异,gga-miR-1618-5p表达显着下调。前期高通量测序结果和qRT-PCR验证结果显示,MAPK10和CASP10可能分别是gga-miR-222b-5p和gga-miR-1618-5p的潜在靶基因。为了确定它们之间是否直接相关,研究彼此间的靶向关系,我们利用生物信息学软件Target Scan和miRBD预测了其结合位点,结果发现只有MAPK10的3’端非编码区（3’UTR）和gga-miR-222b-5p存在种子结合位点,共3处（UGACUCG,UGACUCGU,GACUCGU）。由于前两处结合位点距离较近（654-660,1190-1197）,第三处较远（3890-3896）,我们分别以前两处靶点为中心,第三处靶点为另一中心构建2种含有目的基因片段的双荧光素酶报告基因载体,进行双荧光素酶报告基因实验,结果表明MAPK10确实是gga-miR-222b-5p的靶基因。CASP10作为机体的细胞凋亡因子,MAPK10更是人和动物体重要的肿瘤调节因子,通过对REV-SNV感染SPF雏鸡后同一感染日龄不同免疫器官和不同感染日龄同一免疫器官RLRs信号通路相关miRNAs及上述潜在靶基因表达规律的研究,拓宽了我们对REV感染引起的免疫抑制和肿瘤发生机制的理解,同时有助于深入了解miRNA介导RLRs模式识别受体信号通路参与鸡体免疫抑制的分子调控机制。
南福龙[2]（2021）在《新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究》文中指出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的严重的禽类呼吸道、消化道传染病,给全世界养禽业造成巨大经济损失。NDV属于副粘病毒科,可以通过多种免疫抑制机制逃避宿主的免疫应答。虽然多种副粘病毒都能抑制宿主的抗原递呈,但关于NDV对宿主抗原递呈的影响研究较少。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为体内功能最强的专职抗原递呈细胞（Antigen presentation cell,APC）,摄取抗原后能刺激T淋巴细胞增殖活化,开启体内适应性免疫应答。已有研究表明多种NDV载体疫苗都能诱导机体产生高效的体液与细胞免疫应答,诱导DCs活化,但NDV强毒会诱导DCs凋亡,阻碍抗原递呈,抑制T细胞增殖活化。因此,探究NDV调控DCs活化与抗原递呈抑制机制可以更好地了解NDV免疫逃避机制,也为提升NDV载体疫苗免疫效力提供依据。本研究以NDV弱毒标准株LaSota和小鼠DCs为研究对象,体内外探究NDV的抗原递呈过程及抑制机制。主要研究内容如下:一.NDV感染能诱导小鼠DCs成熟。为探索NDV弱毒LaSota株能否诱导DCs活化,本研究首先以商品化重组IL-4和GM-CSF在体外联合诱导小鼠骨髓单核细胞分化成DCs。利用表达绿色荧光蛋白（EGFP）的r NDV（r NDV-EGFP）感染,发现LaSota能够感染DCs。随后通过流式检测感染后DCs表面成熟标志发现:NDV感染上调了MHC及共刺激分子CD80/86等表面标志;诱导DCs分泌除IL-12p70外的促炎因子TNF-α、IFN-α/β/γ;此外,感染DCs的吞噬能力下降同时具有很强的迁移能力。本研究表明,DCs能够被NDV诱导活化。二.NDV感染抑制DCs抗原递呈并诱导Th2型免疫应答。为揭示NDV对DCs抗原递呈的影响,本研究以CCK-8对DCs和T细胞共培养中T细胞增殖活性进行检测,结果发现NDV处理后的DCs刺激T细胞增殖能力下降,抗原递呈被抑制。感染后共培养CD4+及CD8+T细胞比例下降,Th2型细胞占比升高;DCs感染上清和共培养上清Th2型免疫抑制因子IL-10分泌上升,说明LaSota株感染后会抑制DCs的抗原递呈,并诱导CD4+Th0细胞向Th2型细胞分化。体外验证后,本文构建并拯救了表达2型萤火虫荧光素酶基因的重组新城疫病毒r L-Luc,接种小鼠后进行活体成像。结果表明感染12 h荧光值最高,随后下降,至72 h荧光已经很弱。给小鼠接种NDV,在不同时间点监测脾脏淋巴细胞变化,发现NDV感染小鼠后脾脏DCs含量先下降再上升后稳定,说明抗原递呈主要发生在感染开始至72 h之间;能有效募集成熟DCs至脾脏;脾脏B细胞占比升高,T细胞下降,Th2型细胞显着升高,说明LaSota感染在体内抗原递呈也会诱导Th2型应答。本研究表明NDV会抑制DCs抗原递呈,并在体内外介导Th2型免疫应答。三.NDV通过抑制小鼠DCs IL-12p70分泌抑制T细胞增殖。为探索NDV的抗原递呈抑制机制,本研究先以NDV感染DCs,12 h后以LPS处理48 h,发现NDV会抑制LPS诱导的IL-12p40亚基转录,降低IL-12p70分泌。对IL-12生成通路p38 MAPK通路关键蛋白进行检测发现,NDV感染并未影响通路蛋白总量,但降低了p38和p65在胞质和胞核中磷酸化水平。另外,本研究发现共培养时感染组IL-12p70刺激T细胞分泌的下游细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6均下降。本研究说明NDV通过抑制IL-12生成通路关键蛋白磷酸化入核,抑制IL-12p40生成,从而抑制IL-12p70的分泌和T细胞增殖与细胞因子的分泌。四.NDV通过抑制DCs IL-12p70的分泌增强病毒感染效率。为探究NDV抑制IL-12p70对自身感染的影响,先以r NDV-EGFP感染DCs再共培养,发现NDV能够通过DCs感染T细胞。随后以NDV直接感染T细胞,再以PMA刺激T细胞活化,结果表明NDV感染会抑制PMA刺激的IFN-γ、TNF-α生成。随后将DCs和T细胞的不同感染组合进行共培养,结果表明NDV感染DCs造成的IL-12p70降低是共培养中T细胞增殖和细胞因子分泌抑制的主要原因。接下来以外源宿主相关因子预处理DCs和T细胞再以LaSota感染,结果表明几种被抑制的细胞因子均能有效抑制NDV的感染。最后以不同NDV毒株处理DCs,检测发现多种NDV均会抑制宿主相关因子表达并抑制T细胞增殖活性。本研究表明NDV通过降低IL-12的表达,抑制了下游TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌,以此增强自身对DCs和T细胞的感染效率。综上所述,本研究证明了NDV弱毒LaSota株能诱导小鼠DCs活化,但会抑制p-p65磷酸化入核降低IL-12的分泌从而抑制DCs抗原递呈,在体内外诱导Th2型免疫应答,增强自身感染效率,这种对IL-12的抑制是NDV造成免疫抑制的通用机制。
杨洁[3]（2021）在《TRIM62调节ARPC5抑制禽网状内皮组织增生症病毒复制的研究》文中进行了进一步梳理网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）是一种可以引起禽类免疫抑制以及肿瘤形成的逆转录病毒,且尚无商品化的药物和有效疫苗加以防治,严重危害着养禽业的健康发展。TRIM62（Tripartite motif containing 62）是宿主天然防御因子,本团队前期研究证明TRIM62在体内外对REV的复制均有显着的抑制作用,且对与TRIM62互作蛋白进行筛选分析发现了肌动蛋白相关蛋白复合体2/3（Actin related protein 2/3 complex,Arp2/3复合体）,同时从REV感染DF-1细胞的蛋白组学数据中筛选的差异蛋白ARPC5也属于Arp2/3复合体。Arp2/3复合体的主要功能是促进新微丝的形成,调节肌动蛋白骨架的重排。丝状肌动蛋白（微丝）作为细胞骨架的基本组成部分,在病毒入侵机体的整个过程发挥着重要作用,肌动蛋白影响伪足运动以及微绒毛摆动有利于病毒粒子进入细胞完成侵袭,利于病毒的复制。TRIM62是否可以通过调节ARPC5影响微丝变化从而抑制REV复制不得而知。因此,本研究通过荧光定量PCR检测REV感染24 h、48 h、72 h、96 h、和120 h DF-1细胞中TRIM62以及Arp2/3复合体亚基ARPC5的转录水平,发现TRIM62随着病毒复制量的上升,转录水平呈现先上升后下降的趋势,在72 h达到峰值;ARPC5与TRIM62趋势相反,在病毒复制过程中先下降后上升,并且在72 h显着下调,这提示我们TRIM62可能与ARPC5在病毒复制过程中有相互作用。随后构建过表达慢病毒重组载体,荧光定量PCR以及Western blot检测筛选的ARPC5和TRIM62稳定过表达细胞株,目的基因转录水平显着高于空载组且目的基因蛋白表达成功,证明慢病毒稳转细胞株构建成功。接下来通过ARPC5过表达接毒实验发现,ARPC5过表达后,REV的转录水平以及蛋白表达水平显着上升,随后通过ARPC5的干扰接毒实验发现,ARPC5的下调可以使REV的转录及蛋白表达水平下降,证实ARPC5可以促进REV的复制。根据ARPC5可以利于肌动蛋白丝成核,促进微丝生长的特征,通过对ARPC5过表达慢病毒稳转细胞株以及对照组细胞进行了微丝染色,证明ARPC5可以促进微丝形成。为进一步确定ARPC5与病毒复制之间的关系,本研究用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B阻止微丝的聚合,通过对正常细胞和2.5μM、5.0μM和10.0μM细胞松弛素B处理的细胞进行了持续120 h的形态以及微丝变化观察,确定了72 h为细胞松弛素B处理接毒细胞最佳维持时间,这个时间点可以保证病毒的接种以及药物对微丝的破坏。荧光定量PCR以及Western blot结果显示,阻止微丝聚合可以显着抑制病毒转录水平以及蛋白表达水平,且微丝破坏越严重,抑制病毒复制效果越强。同时选择了2.5μM细胞松弛素B处理的DF-1细胞,在24 h、48 h、72 h、96 h、和120 h收取细胞,这个浓度可以保证细胞的正常存活保证后续检测同时细胞微丝在细胞松弛素B的作用下聚合效果会被持续抑制。运用荧光定量PCR技术检测ARPC5转录水平,发现随着处理时间的延长,由于微丝持续的破坏导致ARPC5的转录水平一直处于下降的趋势,说明阻止微丝聚合可以抑制ARPC5的表达,从而证明ARPC5可以通过调节微丝变化影响病毒复制。通过TRIM62过表达和干扰实验的荧光定量PCR结果发现,接毒情况下,TRIM62的过表达会明显抑制ARPC5的转录水平,干扰TRIM62的表达后,ARPC5的表达会上升,证明TRIM62可以抑制ARPC5的表达。为了进一步确定TRIM62与ARPC5的互作关系,本研究利用激光共聚焦实验发现,TRIM62与ARPC5可以共同定位于细胞浆内,最后利用免疫共沉淀实验证实TRIM62与ARPC5确实存在互作关系。综上所述,本研究证明了ARPC5可以促进病毒的复制,同时指出ARPC5可以通过调控微丝的变化影响病毒的复制;TRIM62可以与ARPC5互相作用,并抑制ARPC5的表达,从而说明TRIM62可以通过调节ARPC5从而影响微丝变化来发挥抗病毒作用。本研究为后续TRIM62抗病毒机制的研究奠定了基础。
闫彩虹[4]（2020）在《江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用》文中指出免疫抑制病病原既可引起家禽发生原发性感染甚至死亡,也可损伤其免疫系统,导致机体抵抗力下降,并发或继发感染其他病原,造成家禽生产能力下降和较高的病死率。鸡传染性贫血病毒（CIAV）、马立克病病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）和禽白血病病毒（ALV）是4种常见的可导致家禽免疫抑制的病毒,在我国养鸡场中检出率较高,且常以亚临床感染的形式出现。目前关于这几种免疫抑制病的流行病学调查研究主要集中在广西、安徽、山东、河南等地区,而关于江苏地区家禽这方面的流行病学研究资料较少。由MDV、REV和J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染引起的肿瘤疾病在临床诊断过程中因症状相似而较难确诊,而且这3种病原的实验室检测还是以常规PCR为主,因此建立一种特异、灵敏、快速的检测方法,用于病原检测和临床诊断,同时为疾病的防控和净化提供帮助是非常有必要的。本研究应用PCR方法对来自江苏地区的病禽进行4种免疫抑制病病原的检测,建立了同时检测3种致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan荧光定量PCR方法,并应用于临床检测中,以期了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的感染情况,并为临床上家禽肿瘤疾病的诊断提供一种快速、特异、敏感的新型技术手段。1 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测为了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的流行情况及其感染间相互作用的关系,应用PCR方法对2016-2019年来自江苏地区不同养殖群体的507只病鸡、80只病鸭、129只病鹅和42只病鸽进行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸检测,结果显示病鸡样品总阳性检出率为66.07%,CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为36.09%、25.84%、10.85%和32.94%,CIAV、MDV、REV和ALV的单一感染检出率分别为13.61%、8.88%、1.18%和12.03%,二重感染以CIAV+ALV最为常见,检出率为7.69%,三重感染以CIAV+MDV+ALV最为常见,检出率为3.94%,四重感染检出率为0.99%。不同日龄鸡检测结果显示,6月龄以上鸡CIAV的检出率显着降低,3～6月龄鸡MDV和ALV的检出率较高;不同品种鸡检测结果显示,蛋鸡MDV、REV检出率显着高于肉鸡、草鸡和三黄鸡;2016-2019年检测结果显示,江苏地区鸡群中免疫抑制病病毒仍呈现不同程度的流行,且部分病原的每年检出率存在差异性。4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较经统计学分析表明,CIAV和REV、CIAV和ALV感染间存在相互促进的趋势（P<0.01）。209份水禽样品均未检测出CIAV核酸,MDV、REV和ALV的检出率分别为0.96%、1.44%和3.35%,个别样品还存在REV和ALV的混合感染。病鸽样品中均未检测出这四种免疫抑制病病原。结果表明,鸡群中免疫抑制病病原的感染非常普遍,且存在多种病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的检出率显着低于鸡群;鸽子感染这4种免疫抑制病病原的机率较低。2鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立为建立同时检测MDV、REV和ALV-J的方法,本研究根据MDV meq基因、REV gp90基因和ALV-J env基因,合成特异性引物和TaqMan探针,建立和优化反应体系和条件,建立了鸡3种致瘤病毒的单个和三重TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的3种病毒的单个荧光定量PCR方法具有相同的反应体系和条件,操作方便,检测快速;单个和多重荧光定量PCR方法均仅特异性扩增MDV、REV和ALV-J,与鸡其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;3种病毒的单个荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×101拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,敏感性较高,三重荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×100拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,与单个敏感性相似;三重荧光定量PCR方法组内与组间重复性试验的Ct值变异系数均小于5%,重复性良好。应用三重荧光定量PCR方法和普通PCR方法分别对来自江苏各地具有免疫抑制病表现的120份临床病鸡样品同时进行MDV、REV和ALV-J核酸的检测,两者的符合率为94.17%。本研究建立的鸡致瘤病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法为临床样品中MDV、REV和ALV-J核酸的检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感的新型技术手段。3两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究为进一步检验三重荧光定量PCR方法的临床应用性,应用建立的三重荧光定量PCR方法对江苏两个鸡场送检的疑似感染肿瘤性病毒的病鸡组织样品进行了检测,并同时进行病毒分离,然后对分离出的MDV野毒株进行meq和pp38两个主要致病基因的序列分析。三重荧光定量PCR结果显示送检病鸡样品MDV核酸均呈阳性,REV和ALV-J核酸均呈阴性,病毒分离鉴定结果显示从两个鸡场的病鸡抗凝全血中各分离到了 1株MDV Ⅰ型毒株,未分离到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示,JS0316毒株与江苏分离株Js201801关系最近,而JS0424毒株则与近年国内流行毒株亲缘相近。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征（A71S,P194-）,具有MDV强毒分离株的分子特征（D80Y,V115A,T139A,P176R）,JS0316分离株meq基因除了具有以上强毒分离株的分子特征外,还与Js201801存在相同的突变（Q93R）,该突变其余参考毒株均未发生,这可能是MDV江苏分离株新的分子生物学特征。除此之外,JS0316和JS0424分离株meq基因分别出现了其他参考毒株均未发生的氨基酸突变（V123A）和（A/P217T）,JS0316和JS0424分离株pp38基因推导的氨基酸序列也分别出现了特有的氨基酸突变（L981,F240S）和（W67G,V210A）。结果表明三重荧光定量PCR检测结果和病毒分离结果一致,发病鸡均感染了马立克病毒,且分离毒株均具有强毒的分子特征。因此,所建三重荧光定量PCR方法可用于临床检测。
许曾焜[5]（2020）在《表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价》文中研究指明重组活载体疫苗是一种以病毒或细菌为载体,将外源保护性抗原基因通过基因工程技术插入载体中并使之表达的疫苗。重组活载体疫苗具有诱导机体产生广泛、长期的免疫反应等优点,并且此类疫苗可同时表达多种抗原,具有成为多价或多联疫苗的潜力,是当下和未来疫苗研制的主要方向之一。马立克氏病病毒（MDV）属疱疹病毒科,其较大的基因组和多个可供外源基因插入的复制非必须区域使之成为构建重组活载体疫苗的良好载体,其中血清3型MDV为火鸡疱疹病毒（HVT）,做为疫苗来预防马立克氏病已有50余年,同时HVT也常被用做载体来表达外源基因。HVT作为载体有许多优势:可接种1日龄雏鸡,不受母源抗体抗扰;非人畜共患,使用安全;一次接种后可持续刺激抗体的产生,无需多次加强免疫;相对于其他全病毒疫苗,只表达保护性抗原成分,不存在毒力返强的风险,并且便于进行免疫监控。新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）强毒株引起的一种禽类烈性传染病,该病致死率极高。对禽类养殖业造成了不可估量的损失。近年来,非典型新城疫的发病率不断增加,呈不同程度的地方性流行,并且在免疫鸡群中也有发生。造成这种现象的原因主要为高水平母源抗体导致的传统疫苗效力降低和ND流行株与疫苗株基因型不匹配等。因此,研制新型有效的疫苗对于ND的防控具有重要意义。本研究旨在建立能够高效拯救病毒的HVT粘粒拯救系统,再将NDV流行株F基因的表达框架插入其中,构建重组病毒并评价其免疫效力,为有效防控新城疫和马立克氏病提供技术支持,具有重要的应用价值。本研究将HVT FC126株基因组分段插入Fosmid粘粒载体pCC1Fos中,构建了FC126株基因组粘粒文库;在此基础上,选取粘粒组合,共转染鸡胚成纤维细胞,建立了HVT FC126疫苗株多片段粘粒拯救系统。通过该拯救系统,将NDV基因VII型流行株LHLJ/01/06株F基因表达框架插入HVT基因组HVT065和HVT066基因之间,构建了重组病毒rHVT-NDV-F。PCR和测序鉴定表明,F基因表达框架成功插入FC126株基因组。间接免疫荧光试验表明,重组病毒rHVT-NDV-F能够表达F蛋白。rHVT-NDV-F重组病毒与其亲本病毒HVT FC126株在体外细胞上的复制能力无显着差异。经过连续传代后,重组病毒rHVT-NDV-F基因组中的F基因表达框架可稳定存在并表达F蛋白。对rHVT-NDV-F重组病毒进行攻毒免疫保护试验,重组病毒rHVT-NDV-F对NDV基因IX型强毒F48E9株的保护率为80%,对NDV基因VII型流行株LHLJ/01/06的保护率为70%。综上,本研究构建了HVT FC126株病毒拯救系统,及能够表达NDV基因VII型F蛋白的重组病毒rHVT-NDV-F;rHVT-NDV-F的体外复制能力与亲本株无显着影响且具有良好的遗传稳定性;该重组病毒能够对当前流行的基因VII型NDV攻毒提供较好的保护,具有作为ND重组HVT活载体疫苗的潜力。
高畅[6]（2020）在《REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响》文中提出禽网状内皮组织增生病（reticuloendotheliosis,RE）是由禽网状内皮组织增生病病毒（reticuloendotheliosis virus,REV）感染禽类宿主引起的一种病理综合征,包括生长迟缓,免疫抑制以及肿瘤发生等。由于REV传播途径多样,宿主范围广泛,因此自从1958年始,REV得以被广泛分布在全世界。此外,疫苗等生物制品也可能被REV污染,从而造成疫苗接种失败,抑制宿主免疫系统使其免疫力降低,导致其他疾病的共发,给畜牧养殖业经济造成巨大损失。本实验通过高通量测序、实时荧光定量PCR等方法手段,检测鸡胚成纤维细胞（CEF）在REV感染过程中可变剪接以及miRNA-155表达的变化,发掘二者在CEF应答REV感染的转录后水平上所发挥的调控作用,为进一步研究REV的免疫致病机制及其对感染动物免疫抑制以及肿瘤形成机制的探讨,提供新的研究方向,同时为该病的防制（治）提供理论依据和新思路。主要研究内容和结果如下:（1）荧光定量检测REV方法的建立将复制得到的病毒液提取RNA经PCR验证后,在紫外灯下可观察到195 bp长度的条带,证明病毒液为REV阳性。将复制成功的病毒液与质粒连接,并进行连续十倍稀释,通过荧光定量PCR得到REV LTR片段的扩增曲线、熔解曲线及标准曲线。各稀释度的重组质粒在达到对数增长期时间距均匀,证明其表达差异呈线性变化,同时阴性对照无扩增,证明本实验无假阳性干扰;扩增产物熔解峰单一,证明无引物二聚体和非特异性扩增,且熔解温度为85.252±0.057℃;REV LTR片段的标准曲线呈线性回归方程,所选取的各稀释度点均在线上,其回归方程为y=2.899x+4.464,相关系数R2=0.9991,证明可信度高。（2）病毒滴度测定于REV感染后第7 d记录细胞完全发生病变的孔数,经计算得到病毒液的TCID50为10-4.625/0.1ml,即将该病毒稀释104.625倍后接种100μl可使50%的细胞发生病变。（3）高通量测序结果及分析将CEFs分为对照组（C组）和病毒感染组（VB组）,每组均有3个重复,6个样本经高通量测序后均得到大量数据,长度为10.2 G-12.92 G,错误率为0.02%,Q20大于96%,Q30大于90%,GC含量在50%左右,去除其中影响分析结果的低质量及含有接头等的数据后,数据仍能达到原始数据的94.6%以上,说明测序数据质量较好。将处理后数据与参考基因组比对发现,70%以上可比对到参考基因组序列上,其中能唯一比对到参考基因组序列上的数据大于90%,说明样品未被污染,且选择的参考基因组是合适的。同时还发现,可比对到参考基因组序列的蛋白编码区域,即外显子的百分比均大于70%,说明检测到的基因绝大多数都是编码蛋白质的基因,也证明了测序的序列都来自于m RNA。在两个比较组中,共发现15973个基因,其中6 939个基因发生了可变剪接,外显子跳跃（SE）事件发生数量为16 860,占总事件数量89.22%,是最普遍的一种剪接模式,也是产生差异最主要的可变剪接模式,上调事件为183,下调事件为524。在C组和VB组间共发现5 607个基因显着差异表达,2 825个基因在REV感染组的表达显着高于对照组,2 782个基因在REV感染组的表达显着低于对照组。差异表达可变剪接基因主要与GO富集分析中的细胞组成相关,如细胞器管腔、膜结合细胞器、细胞质与囊泡等。差异表达可变剪接基因富集较多的KEGG细胞信号转导通路为磷脂酰肌醇信号通路、MAPK信号通路、凋亡、焦点粘连等。（4）高通量测序结果验证随机选择FN1、TNC和SEC61B被剪接的外显子,分别命名为Fe、Te和Se,作为对照,这3个外显子临近未被剪接的外显子同样被检测,依次命名为Fn、Tn和Sn。Fe、Te和Se的泳道没有或仅有少量PCR产物,其余泳道均有明显且长度正确的条带,说明高通量测序预测的可变剪接事件是真实发生的。（5）miR-155表达与REV接毒时间和剂量的关系与C组相比较,VB组接毒后12、24、48、72、96和120 h的miR-155表达量显着上升（P<0.01）,并随病毒作用时间的延长而升高,且二者呈正相关,并于接毒后第72 h达到峰值（P<0.001）。另外,随着REV感染滴度的增加,miR-155表达量也随之升高（P<0.001）,二者呈正相关。（6）miR-155 NC、mimics和inhibitors转染效率检测在荧光倒置显微镜下观察发现,未转染的正常CEFs中未见荧光,而分别转染了miR-155NC,mimics和inhibitors的CEFs胞质中均出现了程度不同的荧光,且荧光效率可达60%以上。经荧光定量PCR检测,转染miR-155 mimics的CEFs中miR-155表达量显着升高（P<0.001）,并随转染时间的延长逐渐增强,转染后第72 h达到较高水平并基本维持不变;转染miR-155 inhibitors的CEFs中miR-155表达量显着降低（P<0.01）,在转染后第12 h即被完全被抑制,并且在转染后72 h内miR-155表达量均保持在较低水平;转染miR-155 NC的CEFs中,miR-155表达量与未经转染的CEFs之间无显着性差异（P>0.05）。（7）REV感染对CEFs活力的影响将CEFs分别分为:C（对照组）、V（只接毒不转染）、VN（接毒后转染miR-155 NC）、VM（接毒后转染miR-155 mimics）和VI（接毒后转染miR-155 inhibitors）组。与C组相比,V组CEFs活力极显着（P<0.001）降低。与V组相比,VM组细胞活力极显着（P<0.001）提高,而VI组细胞活力极显着（P<0.01）降低,VN组与V组间细胞活力无显着性（P>0.05）差异。（8）REV感染对CEFs凋亡及其相关酶活性的影响流式细胞仪检测结果显示,与C组相比,V组凋亡细胞数量极显着（P<0.01）增加。与V组相比,VM细胞凋亡率显着（P<0.05）降低,VI组显着（P<0.05）的增加了CEFs的凋亡率,VN组与V组间细胞凋亡率无显着性（P>0.05）差异。Caspase-3活性检测结果显示,与C组相比,V组中ρNA产量显着（P<0.05）提高。与V组相比,VM组降低ρNA产量,VI组极显着（P<0.01）提高ρNA产量,VN组与V组间ρNA产量未见显着性（P>0.05）差异。（9）REV感染对CEFs细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示,与C组相比,V组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）提高,而S期和G2期细胞极显着（P<0.01）或显着（P<0.05）减少。与V组相比,VM组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）减少,而S期细胞极显着（P<0.01）增加,G2期细胞数量有所增加;VI组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）增加,G2期细胞数量显着（P<0.05）减少,S期细胞相对减少。而VN组与V组间各细胞周期分布无显着性（P>0.05）差异。（10）miR-155靶基因验证经Targetscan、miRanda软件以及高通量测序结果分析发现,caspase-6和FOXO3a是数据库中共同命中的miR-155靶基因。Western Blot（WB）检测结果显示,与C组相比,V组caspase-6和FOXO3a蛋白表达量显着（P<0.05）升高。与V组相比,VM组caspase-6和FOXO3a蛋白表达量显着（P<0.05）降低;VI组FOXO3a蛋白表达量进一步显着（P<0.05）升高,caspase-6蛋白表达量也有所升高。VN组与V组的caspase-6和FOXO3a蛋白表达量未见统计学差异（P>0.05）。上述研究结果为进一步阐明REV感染对CEFs转录后调控的影响,及可变剪接和miR-155在其中所扮演的重要角色提供了重要的科学实验依据,也为进一步在分子水平探讨REV的免疫致病机制提供了新思路。
周放[7]（2020）在《REV感染对HD11和DT40细胞凋亡相关因子表达的影响》文中研究表明近年来,随着动物养殖业的快速发展,疾病的防治（制）变得尤为重要。由于REV感染动物所产生的免疫抑制,容易造成其他病原的继发和混发感染,给该病的诊断和防治（制）带来更大的难度。而研究REV感染与免疫细胞的相互作用,有利于了解其免疫抑制及肿瘤形成的原因,阐明其致病机制,为RE的防治（制）提供理论基础。因此,本研究针对REV免疫抑制的特征,选取HD11（鸡巨噬细胞系）和DT40（鸡淋巴瘤细胞）为研究对象,应用分子生物学技术和免疫学方法结合检测试剂盒,通过对REV感染上述细胞后病毒载量、细胞线粒体膜电位和Ca2+含量及细胞凋亡率等进行检测,同时测定了细胞线粒体途径重要凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA表达和蛋白含量变化,主要研究结果如下:（1）于REV感染的HD11、DT40细胞中均检测到了该病毒,表明REV可在HD11和DT40细胞中复制增殖。且在病毒感染HD11细胞后48 h,病毒载量到达峰值;REV感染DT40细胞后12-72 h,其病毒载量均呈上升趋势。（2）REV感染HD11细胞后24-36 h,其细胞活力极显着（P<0.01）低于对照细胞。REV感染DT40细胞后,其细胞活力在12 h显着（P<0.05）低于对照细胞,在48h极显着（P<0.01）低于对照细胞。（3）REV感染HD11和DT40细胞后,其细胞线粒体膜电位分别在病毒感染后36-48 h、36-72 h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）低于对照细胞。（4）REV感染HD11和DT40细胞后,其细胞内Ca2+含量均在36 h和48 h显着（P<0.05）高于对照细胞;其余时间点虽也高于对照细胞,但无统计学意义（P>0.05）。（5）REV感染HD11细胞后24-36 h和72 h,其细胞凋亡率均极显着（P<0.01）高于未感染病毒的对照细胞,12 h虽然病毒感染细胞凋亡率较对照细胞有所增加,但无统计学差异（P>0.05）;REV感染DT40细胞后12 h、48 h和72 h,DT40细胞凋亡率极显着（P<0.01）高于对照细胞。（6）REV感染HD11细胞后,其Bcl-2 mRNA表达在24-36 h极显着（P<0.01）低于对照细胞,而48-72 h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于对照细胞;Bax mRNA表达在24 h显着（P<0.05）低于对照细胞,在48 h和72 h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于对照细胞;caspase-3 mRNA表达在36 h和72 h极显着（P<0.01）高于对照细胞;caspase-9mRNA表达在12 h、36 h和72 h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于对照细胞。REV感染DT40细胞后,其Bcl-2 mRNA表达在12 h、48-72 h均极显着（P<0.01）高于对照细胞;Bax mRNA在12-72 h期间均未能检测到表达（Ct值≥35）;caspase-3 mRNA表达在24 h极显着（P<0.01）高于对照细胞,在36 h和72 h显着（P<0.05）高于对照细胞;caspase-9 mRNA表达在24-36h极显着（P<0.01）高于对照细胞,在72h显着（P<0.05）高于对照细胞;其他均未见统计学差异（P>0.05）。（7）REV感染HD11细胞后12-72 h,其caspase-3酶活性均极显着（P<0.01）高于对照细胞;Bcl-2蛋白含量在24和72 h极显着（P<0.01）低于对照细胞;caspase-9蛋白含量在12-48h极显着（P<0.01）高于对照细胞。REV感染DT40细胞后,其caspase-3酶活性在36～48 h和72 h均明显（P<0.01或P<0.05）高于对照细胞;Bcl-2蛋白含量在12和48 h极显着（P<0.01）高于对照细胞,而在72 h极显着（P<0.01）低于对照细胞;caspase-9蛋白含量在12-24 h极显着（P<0.01）高于对照细胞,在48 h极显着（P<0.01）低于对照细胞;其余均未见统计学差异（P>0.05）。通过上述各项指标的检测,旨在探究线粒体凋亡途径在REV感染细胞过程中的功能和作用,为深入阐述REV的免疫抑制机制和线粒体凋亡途径在病毒感染所致凋亡中的作用提供新的理论依据。
张淑君[8]（2020）在《REV感染对鸡骨髓源树突状细胞Toll样受体及其信号通路的影响》文中研究说明禽网状内皮组织增生症病毒（reticuloendotheliosis virus,REV）是一种引起禽免疫抑制和矮小综合征等代表性特征的C型禽逆转录病毒。该病毒感染造成禽类宿主免疫抑制后,使宿主易发生二次感染或/和混合感染,加重禽类疫病的程度,同时增加禽类疾病发病率和死亡率,给全球养禽业造成严重经济损失。最近有研究报道,REV对新的宿主具有潜在威胁,因此,研究REV的致病机制,特别是其免疫抑制机制尤为重要,在公共卫生学上也具有实际意义。树突状细胞（dendritic cells,DC）是目前已知抗原提呈功能最强的免疫细胞,它是先天性免疫和后天获得性免疫的桥梁,在机体免疫应答中发挥重要作用。DC的类型不同,其功能也不完全相同,未成熟树突状细胞具有很强的抗原吞噬能力,吞噬抗原后细胞逐渐成熟;成熟的树突状细胞呈递抗原能力较强,因此具有很强的免疫激活能力,可激活T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞等。本研究以鸡骨髓源树突状细胞（chicken bone marrow derived dendritic cells,ch BM-DC）为对象,在成功建立REV感染ch BM-DCs模型的基础上,应用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞的形态变化,应用流式细胞术检测细胞表面标志,应用实时荧光定量PCR、间接ELISA方法,较全面系统对REV感染ch BM-DCs后,其Toll样受体（Tolllike receptors,TLR）介导的抗病毒天然免疫进行研究,主要结果如下:（1）通过形态观察发现,体外诱导培养的鸡骨髓源细胞具备DCs典型形态特点,通过检测细胞表面标志CD11c、MHCⅡ,鉴定诱导培养的ch BM-DCs具有较高纯度,结果表明,成功诱导出大量且高纯度的鸡骨髓源树突状细胞。（2）通过设计两因素四水平实验,优化细胞培养条件,在此条件下培养细胞,通过CCK-8法测定了细胞生长情况,并绘制了细胞生长曲线,结果表明,细胞生长状态良好。（3）通过PCR方法对病毒的感染进行鉴定,结果发现,在REV感染的ch BM-DCs中检测到REV的特异性LTR保守序列,而未感染REV的对照细胞中未扩增出该基因。表明成功建立REV感染ch BM-DCs模型。（4）通过检测正常组、LPS组和REV感染组DCs形态变化及表面标志表达情况,结果显示,相比LPS刺激组,REV感染组细胞表面突起较短,且MHCⅡ表达显着降低,表明REV对树突状细胞的成熟具有一定抑制作用。（5）REV感染ch BM-DCs后6h,细胞中TLR3、TLR7、TLR21、TRIF、My D88、NF-κB m RNA表达均极显着（P<0.01）高于对照细胞;病毒感染后12、24和48h,细胞中TLR3 m RNA表达极显着（P<0.01）低于对照细胞;TLR7、TLR21 m RNA表达于病毒感染后12和24h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）低于对照细胞,于病毒感染后48和72h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于对照细胞;TRIF m RNA表达于病毒感染后12和24h极显着（P<0.01）低于对照细胞,其他被检时间点未见统计学差异;My D88 m RNA表达于病毒感染后12h显着（P<0.05）低于对照细胞,48h显着（P<0.05）高于对照细胞,其他被检时间点未见统计学差异;NF-κB m RNA表达于病毒感染后24和48h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于对照细胞。表明REV感染早期可以强烈引起TLR受体介导的先天性免疫反应,但随着病毒的不断复制,REV通过抑制TLRs及其相关因子的表达,从而逃避TLRs对其的识别。（6）REV感染ch BM-DCs后,细胞中IL-6 m RNA表达于病毒感染后6h极显着（P<0.01）高于对照细胞,IL-6蛋白含量于病毒感染后12和72h极显着（P<0.01）高于对照细胞;IFN-βm RNA表达及蛋白含量于病毒感染后6和12h显着或极显着（P<0.05 or P<0.01）高于对照细胞:IFN-β蛋白含量于病毒感染后24和48h均显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）低于对照细胞,72h极显着（P<0.01）高于对照细胞;IL-8 m RNA表达及蛋白含量于病毒感染后6、12、24和48h明显（P<0.05或P<0.01）高于对照细胞,其他被检时间点未见统计学差异。表明REV在感染早期可以强烈引起ch BM-DCs的抗病毒反应和炎症反应,但随着病毒的不断复制,REV通过逃避TLRs对其的识别而抑制宿主细胞产生干扰素,从而促进其在宿主细胞内的存活及增殖。
仇玲玲[9]（2020）在《鸡circRNA2420-Bcl11b介导细胞凋亡调控ALV-J感染的作用机制》文中指出J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）是一种反转录病毒,引起家禽免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤,给养殖业带来严重的经济损失。相对于其他亚型,ALV-J拥有更强的致病性和传染性,也是目前我国鸡群中发病率最高、感染较为严重、影响深远的一种亚群。目前还没有发现有效的商业化药物或疫苗可供使用,其感染致病致瘤机制有待进一步研究。本研究基于前期ALV-J感染与正常脾脏组织的转录组数据,结合小RNA测序数据,通过生物信息学联合分析筛选出与ALV-J感染致瘤相关的转录本（包括mRNAs、circRNAs、lncRNAs或miRNAs）、转录本间可能的网络互作关系以及病毒感染的关键信号通路。然后从上游和下游两个角度揭示鸡Bcl11b（B-cell lymphoma/leukemia 11B）在ALV-J病毒感染过程中的作用及分子调控机制,并以期进一步完善ALV-J感染致瘤机制的基础研究,也为寻找有效的生物标记以提高抗病育种工作提供理论基础。主要研究内容如下:1.为了探索家禽中ALV-J感染过程中关键基因、circRNAs、lncRNAs以及ceNRA互作网络关系,同时为解析鸡J亚群禽白血病病毒感染分子调控机理提供基础资料,本研究利用已有的ALV-J自然感染发病与正常脾脏组织的转录组数据,结合同样本的小RNA测序数据,获得全面系统的ALV-J感染与非感染鸡脾脏组织的转录组数据,并且通过差异表达转录本韦恩图联合分析、功能富集分析以及ceRNA互作网络等生物信息学手段共筛选出与ALV-J感染致病致瘤相关的15个候选基因（包括Bbx、Bcl11b、Foxk1、Pag1、Tyro3、Brat1、Ctsb、Scube3、Ulk3、Dock4、Zfhx3、Fmr1、Aoc3、Ralb 以及 Mll）、多个相关转录本及转录本间可能的网络互作关系以及病毒感染的关键信号通路,通过在其他感染组织中验证发现Bcl11b表达水平差异最为显着,达80倍,且Bcl11b信号通路复杂,可能是ALV-J感染致病致瘤的关键因子。因此,首先将鸡Bcl11b基因作为研究ALV-J感染致病致瘤的机制切入点。2.为探讨鸡Bcl11b基因的功能,首先克隆获得了鸡Bcl11b的CDS序列,发现存在可变剪接体,并且发现一种新的剪接形式,蛋白结构预测分析发现3号外显子缺失会影响蛋白质三级结构的锌离子结合位点;qRT-PCR检测结果发现鸡Bcl11b在肝、脾、肺、淋巴和肾等组织中均有表达,且在脾、肺和淋巴中高表达,在鸡胚成纤维细胞中高表达;进一步在Bcl11b基因低表达的细胞DF-1中过表达Bcl11b同时检测细胞增殖活力、凋亡及周期变化,发现Bcl11b的过表达显着降低了细胞活力、提高了细胞凋亡水平（P<0.05）,促凋亡基因表达量也显着升高（P<0.05）,对细胞周期影响不显着（P>0.05）,在CEF细胞中干扰Bcl11b表达后细胞凋亡水平显着降低（P<0.05）,对细胞周期影响不显着（P>0.05）。这说明了鸡Bcl11b通过促进细胞的凋亡从而抑制细胞活力和存活,而非阻滞细胞周期。3.为了进一步探索鸡Bcl11b基因在ALV-J感染过程中的作用,首先构建了 ALV-J体外感染CEF细胞产生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的模型,检测体外感染过程中Bcl11b基因表达水平变化趋势与细胞凋亡水平一致,同时检测多个凋亡相关蛋白发现p53蛋白水平在感染后0～2 dpi高表达,其下游蛋白Bax表达水平在在感染后0～3dpi表达水平较高,下游作用因子细胞色素C（CytC）在2-4dpi高表达,符合p53调控的线粒体介导的细胞凋亡模式;Bcl11b基因和凋亡相关基因的表达与凋亡变化吻合。这也说明在体外,鸡Bcl11b基因参与线粒体介导的细胞凋亡。4.进一步探讨了 miRNA靶向Bcl11b参与ALV-J感染的分子机制,本研究首先克隆获得鸡Bcl11b 3’UTR序列1755 nt;通过miRDB、Targetscan、PicTar等在线预测软件并与测序分析数据结合预测靶向鸡 Bcl11b基因的miRNAs并结合双荧光素酶报告系统验证gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p可以靶向鸡Bcl11b;通过分别对miRNAs的过表达和抑制同时检测对鸡Bcl11b的表达水平以及细胞凋亡、周期的影响,结果发现gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p可以通过靶向Bcl11b影响Bcl11b基因的转录和翻译,进而影响了被转染细胞的凋亡水平;通过对ALV-J体外感染CEF细胞过程中Bcl11b基因表达水平、细胞凋亡水平出现拐点的时候（3～5dpi）抑制内源性gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p的表达,发现靶基因Bcl11b表达水平显着上调,细胞凋亡水平也显着上调（P<0.05）。这表明gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p通过靶向Bcl11b基因介导细胞凋亡。5.为了探究circRNA2420-miRNA-Bcl11b的调控机制,首先通过qRT-PCR、分子克隆等方法对circRNA2420特征进行分析,发现其是高稳定闭合环状转录本,且其成环并不依赖侧翼内含子上的重复序列;接着对circRNA<sub>2420进行过表达和干扰表达,检测鸡Bcl11b的表达以及细胞的凋亡水平变化,发现过表达circRNA2420后Bcl11b表达量显着上调（P<0.05）,细胞凋亡水平也随之上调（P<0.05）;反之干扰circRNA2420表达后Bcl11b表达量显着下调（P<0.05）,细胞凋亡水平也相应下降（P<0.05）,但是细胞周期没有变化（P>0.05）;通过双荧光素酶报告系统验证靶向Bcl11b基因的两个miRNA（gga-miR-1612 和 gga-miR-6701-3p）与 circRNA2420 的作用方式以及鸡Bcl11b与circRNA2420的互作,发现gga-miR-1612可以靶向结合鸡circRNA2420影响荧光素酶活性,circRNA2420也间接影响了Bcl11b基因的活性。说明circRNA2420可以通过吸附miRNAs（包括gga-miR-1612）调控鸡Bcl11b的表达,进而影响细胞的凋亡。6.为了探究Bcl11b介导细胞凋亡的机制,通过ChIP-seq实验发现Bcl11b作为一种锌指蛋白转录因子可以靶向多个细胞凋亡相关的基因进而参与细胞凋亡及信号通路等多种生物学过程,为揭示Bcl11b的功能及作用机制提供了线索。综上所述,本研究发现ALV-J感染过程中circRNA<sub>2420可以通过吸附miR-1612间接促进鸡Bcl11b基因的表达,而Bcl11b作为一种锌指蛋白转录因子调控凋亡相关基因的转录,进而介导细胞的凋亡调控ALV-J感染。研究结果进一步完善ALV-J感染致瘤机制的基础研究,也为寻找有效的生物标记以提高抗病育种工作提供新的靶点和思路。
何书海[10]（2019）在《J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受的致病机制研究》文中认为J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种致瘤性逆转录病毒,在临床上主要诱发肉鸡和蛋鸡发生髓系细胞白血病和其它各种类型的肿瘤性疾病。自1991年该病毒被发现以来,ALV-J在全世界范围内的各种鸡群中广泛流行并呈现间歇性爆发之势,曾对世界范围内的养鸡业造成了毁灭性打击。目前,ALV-J在我国各品系鸡群中的感染相当普遍,给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。除了造成鸡的生产性能下降和诱发肿瘤外,一个更为严重但也容易被忽视的问题是ALV-J感染会造成被感染鸡出现严重的免疫耐受,且免疫耐受是肿瘤形成和机会性感染的必要条件。遗憾的是,迄今为止人们对ALV-J诱导免疫耐受的根本原因和机制知之甚少,所以阐明ALV-J诱导宿主免疫耐受的发病机制对防控该病具有现实而重要的意义。本研究通过建立ALV-J免疫耐受感染实验模型,从发育学、细胞学、免疫学及分子生物学角度明确ALV-J感染鸡的免疫状况及其与免疫耐受形成之间的内在联系;利用现代生命科学前沿技术,检测和分析了ALV-J感染细胞内相关蛋白的表达差异,明确其在B细胞发育和功能相关信号通路中的作用,并对ALV-J的分子致病机制进行理论概括。为研究先天性感染与后天感染诱导免疫耐受的差异,本研究分别通过胚内注射ALV-J模拟先天感染和雏鸡注射ALV-J模拟后天感染的方式建立了实验模型。研究发现,ALV-J胚内感染可造成被感染鸡出现持续性病毒血症但没有抗体反应（即免疫耐受）,而雏鸡时感染ALV-J则只有一部分鸡表现为免疫耐受。通过ELISA检测发现免疫耐受鸡血液中总免疫球蛋白（Ig M和Ig G）水平显着降低。进一步运用免疫组织化学法检测了免疫耐受鸡免疫器官中Ig M+和Ig G+B细胞的数量和发育动态,检测和评价了被感染鸡脾脏B细胞应对胸腺非依赖型抗原脂多糖（LPS）刺激后的活化与增殖能力。结果显示,免疫耐受鸡体内的B细胞向Ig M+和Ig G+抗体生成细胞（特别是Ig G型细胞）发育和分化的能力受到严重的抑制;脾脏生发中心B细胞应对有丝分裂原刺激后活化与扩增能力也被抑制。为了解ALV-J先天感染与后天感染鸡对特异性抗原刺激的免疫应答能力的差异,进一步检测了宿主应对绵羊红细胞（SRBC）及马立克氏病病毒（MDV）减毒1型疫苗刺激所产生的Ig M型和Ig G型抗体滴度。结果显示,先天感染鸡所产生的抗原特异性Ig M型和Ig G型抗体滴度显着降低;然而,虽然后天感染鸡体内抗原特异性Ig G型特异性抗体滴度显着降低,但Ig M型抗体滴度基本正常,这些数据提示ALV-J后天感染对鸡体内B细胞的早期发育影响不大。综合以上实验结果可知,ALV-J先天感染抑制了B细胞的发育及成熟,并抑制了B细胞免疫球蛋白的生成和抗体类别转换能力。为了进一步探明ALV-J先天感染诱导免疫耐受的细胞学机制,本研究检测了自鸡胚发育到雏鸡的各时段法氏囊B细胞发育动态。细胞形态学检测结果显示,ALV-J胚内感染鸡法氏囊发育严重不良且大部分淋巴滤泡不能分化为明显的髓质和皮质,提示这些淋巴滤泡处于幼稚状态;然而孵化后感染ALV-J的鸡法氏囊发育虽然也受到抑制,但大部分淋巴滤泡能够形成皮质部。这些结果证实ALV-J先天感染对鸡法氏囊B细胞的发育影响更大。流式细胞分析结果进一步发现ALV-J胚内感染会造成更高的B细胞感染率（约27%）,且免疫组化结果显示这些gp85抗原阳性B细胞体积和核桨比例较大,大多处于发育早期阶段。以上结果说明,ALV-J的先天感染会导致了胚胎B细胞的后期发育抑制,并因此造成B细胞抗体生成障碍。流式细胞分析结果证实ALV-J阻断了法氏囊中CD117+祖B细胞的分化,并且体外实验进一步证实ALV-J抑制了CD117+B细胞体外增殖能力和应答LPS和IL-4刺激所发生的免疫球蛋白基因类别转换重组能力。综合分析以上体内外实验数据,提示ALV-J诱导的免疫耐受与B细胞发育受阻和功能障碍密切相关,而导致B细胞出现这种“无能”状态的关键原因就是ALV-J选择性作用于早期发育的B细胞并抑制它们的进一步发育和成熟。相关ALV-J感染细胞的蛋白质组学检测结果显示,ALV-J感染改变了DF-1细胞中酪氨酸激酶Lyn的蛋白表达水平。Lyn是B细胞BCR信号通路中的核心因子,其参与了B细胞增殖、分化、成熟或耐受等相关生物学过程。因此,为明确ALV-J诱导B细胞无能的分子机制,本研究进一步分析了ALV-J对B细胞中Lyn的表达调控及对BCR信号转导的影响。Western-blot及免疫组织化学检测结果显示,ALV-J胚内感染鸡法氏囊细胞中的Lyn表达水平上升。因体内实验显示ALV-J感染鸡B细胞中Lyn表达异常,本研究进一步在体外实验中研究了ALV-J对Lyn表达的影响。通过激光共聚焦显微镜观察发现,ALV-J感染B细胞后其病毒gp85蛋白主要分布于细胞浆,同时也有一部分B细胞的胞浆和胞核均有病毒gp85的阳性信号。q RT-PCR和Western-blot检测结果与体内实验结果一致,即ALV-J感染导致B细胞内Lyn的m RNA转录水平和蛋白合成水平均被上调。Lyn在BCR信号转导中同时具有正调控和负调控作用,而这种正负调控作用取决于其不同磷酸化位点的活化水平。为明确Lyn在ALV-J感染组B细胞中发挥的主导作用,本研究进一步检测了BCR信号激活后Lyn蛋白的磷酸化水平及其下游直接底物Syk蛋白的磷酸化水平。流式细胞术分析结果显示,当激活BCR信号后,感染组B细胞中Tyr397位点（激活正调控作用）和Tyr507位点（激活负调控作用）的磷酸化水平均不同程度的增强。此时,作为BCR信号转导的核心激酶同时也是Lyn的直接底物Syk的磷酸化水平就显得尤为重要。流式细胞分析结果显示,此时Syk的磷酸化水平显着下降,提示Lyn在感染组B细胞中主要发挥了抑制BCR信号转导的作用。为了确证这种作用,本研究进一步对B细胞中的Lyn进行了sh RNA干扰并检测了相关蛋白的磷酸化水平。检测结果显示,对感染组B细胞实施Lyn的sh RNA干扰后,其下游蛋白Syk的磷酸化水平显着回升。以上实验数据进一步说明Lyn在感染B细胞中发挥了抑制BCR信号转导的作用,从而导致了B细胞BCR信号级联反应受阻。综上所述,ALV-J诱导的免疫耐受与B无能有关,其根本原因在于ALV-J阻滞了CD117+祖B细胞的发育和分化;而导致B细胞发育和分化障碍的分子机制是ALV-J激活了Lyn在BCR信号转导中的抑制性作用。总之,本研究从细胞和分子两个维度全面解析了ALV-J诱导免疫耐受机制,为禽白血病的防控及揭示相关病毒诱导免疫耐受的机制研究提供了理论依据。
二、禽类免疫抑制/干扰（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽类免疫抑制/干扰（论文提纲范文）
（1）REV-SNV对SPF雏鸡RLRs信号通路相关MiRNAs及其靶基因表达的影响（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽网状内皮组织增生症的研究概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 临床症状及病理变化 |
| 1.1.4 REV与其他禽类病毒的混合感染 |
| 1.2 RIG-I样受体家族信号通路的研究概述 |
| 1.3 MicroRNAs的研究概述 |
| 1.4 实时荧光定量PCR技术的研究概述 |
| 1.5 双荧光素酶报告基因验证法的研究概述 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 相关溶液配制 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 7、14、21dpi法氏囊中RLRs通路相关miRNAs及其相关基因表达规律的研究 |
| 2.2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.2.1.2 组织RNA的提取 |
| 2.2.1.3 RT反应 |
| 2.2.1.4 标准曲线的建立 |
| 2.2.1.5 qPCR验证 |
| 2.2.1.6 结果计算与统计学分析 |
| 2.2.2 28、35、42dpi脾脏RLRs通路相关miRNAs及其相关基因表达规律的研究 |
| 2.2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2.2 组织RNA的提取 |
| 2.2.2.3 RT反应 |
| 2.2.2.4 qPCR验证 |
| 2.2.2.5 结果计算与统计学分析 |
| 2.2.3 gga-miR-222b-5p与 MAPK10 的靶向验证 |
| 2.2.3.1 生物信息学预测 |
| 2.2.3.2 引物及目的片段的合成 |
| 2.2.3.3 pmirGLO质粒的线性化 |
| 2.2.3.4 线性化载体和目的片段酶切产物回收 |
| 2.2.3.5 线性化pmirGLO质粒与MAPK10 3’UTR连接 |
| 2.2.3.6 线性化pmirGLO质粒与MAPK10 3'UTR突变型连接 |
| 2.2.3.7 大肠杆菌感受态(DH5α)的制备 |
| 2.2.3.8 重组载体质粒转化感受态细胞 |
| 2.2.3.9 阳性克隆鉴定 |
| 2.2.3.10 重组载体质粒的抽提 |
| 2.2.3.11 重组载体质粒双酶切鉴定 |
| 2.2.3.12 重组质粒的测序鉴定 |
| 2.2.3.13 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2.3.14 细胞传代 |
| 2.2.3.15 细胞转染 |
| 2.2.3.16 重组质粒与miR-222b-5p或 miR-222b-5pNC分别转染鸡胚成纤维细胞 |
| 2.2.3.17 双荧光素酶报告基因实验试剂的制备 |
| 2.2.3.18 双荧光素酶报告基因活性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 标准曲线的建立 |
| 3.2 7、14、21dpi法氏囊中RLRs信号通路相关miRNAs及其相关基因的表达规律 |
| 3.3 28、35、42dpi脾脏中RLRs信号通路相关miRNAs及其相关基因的表达规律 |
| 3.4 gga-miR-222b-5p与 MAPK10 的靶向验证 |
| 3.4.1 生物信息学预测结果 |
| 3.4.2 重组载体质粒的双酶切验证结果 |
| 3.4.3 重组载体质粒的测序结果 |
| 3.4.4 双荧光素酶活性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 REV-SNV感染SPF鸡法氏囊和脾脏中RLRs通路相关基因表达规律分析 |
| 4.2 REV-SNV感染SPF鸡法氏囊和脾脏中RLRs通路相关miRNAs表达规律分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒蛋白功能及载体疫苗研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒结构 |
| 1.1.2 NDV基因组和功能蛋白 |
| 1.2 NDV免疫逃避机制 |
| 1.2.1 V蛋白抑制JAK/STAT通路 |
| 1.2.2 V蛋白降解模式识别受体MDA-5 |
| 1.2.3 V蛋白抑制MAVS的信号转导 |
| 1.2.4 V蛋白促进MEK/ERK通路的激活 |
| 1.2.5 V蛋白抑制细胞凋亡 |
| 1.3 新城疫载体疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 新城疫载体疫苗发展历史 |
| 1.3.2 新城疫载体疫苗的应用 |
| 第二章 树突状细胞与抗原递呈 |
| 2.1 DCs的亚群分类 |
| 2.1.1 经典DC |
| 2.1.2 其他DC亚群 |
| 2.2 DC与抗原递呈 |
| 2.2.1 DC的抗原摄取与迁移 |
| 2.2.2 DC的成熟与T细胞活化 |
| 2.2.3 CD4~+T细胞分化 |
| 第三章 副粘病毒抑制抗原递呈 |
| 3.1 副粘病毒对DC功能的影响 |
| 3.1.1 对DC表面成熟标记的影响 |
| 3.1.2 对DC细胞因子分泌的影响 |
| 3.1.3 对DC迁移的抑制 |
| 3.1.4 对DC吞噬能力的影响 |
| 3.2 副粘病毒抑制DC与T细胞的互作 |
| 3.2.1 诱导共培养细胞的凋亡 |
| 3.2.2 感染后DC表面糖蛋白会抑制T细胞增殖 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 NDV感染诱导DC成熟 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 毒株、细胞及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 小鼠骨髓源DC的分离培养 |
| 1.1.4 小鼠淋巴细胞分离 |
| 1.1.5 流式细胞术检测 |
| 1.1.6 上清细胞因子分泌的测定 |
| 1.1.7 DC的抗原摄取能力检测 |
| 1.1.8 DC迁移能力检测 |
| 1.1.9 DC细胞活性测定 |
| 1.1.10 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 BMDCs的培养与鉴定 |
| 1.2.2 NDV的感染效率检测 |
| 1.2.3 DC表面成熟分子标志检测 |
| 1.2.4 DC细胞因子分泌检测 |
| 1.2.5 DC吞噬能力检测 |
| 1.2.6 DC迁移能力检测 |
| 1.2.7 DC和T细胞的凋亡检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 宿主选择及NDV感染效率 |
| 1.3.2 小鼠DC感染后表型成熟 |
| 1.3.3 NDV弱毒感染并未诱导过高凋亡水平 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 NDV感染抑制DC抗原递呈并诱导Th2型应答 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 毒株、质粒及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 T细胞增殖(抗原递呈)检测 |
| 2.1.4 上清细胞因子分泌的测定 |
| 2.1.5 表达萤火虫荧光素酶的重组新城疫质粒prL-Luc构建 |
| 2.1.6 重组病毒的拯救 |
| 2.1.7 重组病毒的鉴定 |
| 2.1.8 荧光素酶活性检测 |
| 2.1.9 动物实验及分组 |
| 2.1.10 流式细胞术 |
| 2.1.11 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NDV感染DC体外刺激小鼠T细胞增殖能力检测 |
| 2.2.2 共培养上清细胞因子分泌检测 |
| 2.2.3 NDV感染DC体外刺激小鼠T细胞分化能力检测 |
| 2.2.4 NDV诱导抑炎因子IL-10 的检测 |
| 2.2.5 prL-Luc质粒构建 |
| 2.2.6 重组病毒的鉴定 |
| 2.2.7 小鼠活体成像观察 |
| 2.2.8 脾脏DC成熟水平检测 |
| 2.2.9 脾脏淋巴细胞检测(体内抗原递呈) |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NDV感染的DC功能不成熟导致小鼠T细胞增殖抑制 |
| 2.3.2 NDV感染会诱导免疫抑制因子IL-10 表达 |
| 2.3.3 NDV在小鼠的体内抗原递呈 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 NDV通过抑制小鼠DC IL-12p70分泌抑制T细胞增殖 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 毒株及实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 DC的细胞处理与分组 |
| 3.1.4 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3.1.5 上清细胞因子分泌的测定 |
| 3.1.6 流式细胞术检测 |
| 3.1.7 Western blot检测 |
| 3.1.8 p-p65的ELISA检测 |
| 3.1.9 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 NDV抑制IL-12p70的生成 |
| 3.2.2 NDV通过抑制IL-12p40表达抑制IL-12p70生成 |
| 3.2.3 NDV通过抑制p38通路抑制p65的磷酸化入核 |
| 3.2.4 NDV感染并未抑制IL-12 受体表达 |
| 3.2.5 NDV感染抑制小鼠DC刺激T细胞的炎性因子分泌 |
| 3.2.6 外源细胞因子添加能恢复NDV造成的小鼠T细胞抑制 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 NDV抑制IL-12 的方式 |
| 3.3.2 NDV通过IL-12抑制小鼠T细胞下游细胞因子分泌和增殖 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV通过抑制DC IL-12p70的分泌增强病毒感染效率 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 毒株及实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 NDV的感染效率检测 |
| 4.1.4 NDV直接抑制T细胞的细胞因子生成和抗原递呈检测 |
| 4.1.5 不同NDV对抗原递呈的抑制水平 |
| 4.1.6 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 NDV抑制小鼠T细胞的细胞因子表达 |
| 4.2.2 IL-12p70降低是抗原递呈抑制的主要原因 |
| 4.2.3 IL-12 可以抑制NDV的感染 |
| 4.2.4 IFN-γ、TNF-α 和IL-6 均可以抑制NDV感染T细胞 |
| 4.2.5 多种NDV均能通过抑制IL-12造成小鼠T细胞增殖抑制 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 NDV能通过小鼠DC感染T细胞造成增殖抑制 |
| 4.3.2 NDV抑制IL-12 及下游细胞因子分泌增强感染效率 |
| 4.3.3 多株NDV都能抑制DC IL-12 分泌抑制T细胞增殖 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）TRIM62调节ARPC5抑制禽网状内皮组织增生症病毒复制的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 REV的概述 |
| 1.1.1 REV的生物学特征 |
| 1.1.2 REV的流行病学特征 |
| 1.1.3 REV的致病性及危害 |
| 1.2 TRIM62 蛋白研究进展 |
| 1.2.1 TRIM家族蛋白的概述 |
| 1.2.2 TRIM62 蛋白的结构和功能 |
| 1.3 Arp2/3 复合体蛋白家族 |
| 1.3.1 Arp2/3 复合体的构成 |
| 1.3.2 Arp2/3 复合体的作用 |
| 1.4 本课题的研究目的与意义 |
| 2.材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂及耗材 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要缓冲液 |
| 2.1.4 实验地点 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DF-1 细胞的培养 |
| 2.2.2 病毒接种 |
| 2.2.3 sh RNA干扰质粒及慢病毒重组载体的细胞转染 |
| 2.2.4 慢病毒重组载体的构建 |
| 2.2.5 慢病毒重组载体转染DF-1 细胞MOI值确定 |
| 2.2.6 慢病毒稳转细胞株的构建 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.8 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.9 肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B的影响 |
| 2.2.10 激光共聚焦观察ARPC5与TRIM62 的细胞共定位 |
| 2.2.11 免疫共沉淀 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 REV感染DF-1 细胞后REV、TRIM62和ARPC5 转录水平变化 |
| 3.2 慢病毒稳转细胞株的筛选 |
| 3.2.1 嘌呤霉素对DF-1 细胞最低致死浓度确定 |
| 3.2.2 慢病毒重组载体转染DF-1 细胞最佳MOI值确定 |
| 3.2.3 慢病毒稳转细胞株筛选 |
| 3.2.4 慢病毒稳转细胞株的鉴定 |
| 3.3 ARPC5对REV复制的影响 |
| 3.3.1 ARPC5 过表达促进病毒复制 |
| 3.3.2 ARPC5 的干扰抑制REV复制 |
| 3.4 ARPC5 调控微丝变化促进REV复制 |
| 3.4.1 ARPC5 过表达促进微丝形成 |
| 3.4.2 肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B浓度筛选 |
| 3.4.3 不同浓度细胞松弛素B对REV复制的影响 |
| 3.4.4 不同时间点细胞松弛素B处理细胞ARPC5 的转录水平变化 |
| 3.5 TRIM62 抑制ARPC5 的表达并与其互作 |
| 3.5.1 TRIM62 表达对ARPC5 的影响 |
| 3.5.2 TRIM62与ARPC5 蛋白互作 |
| 4.讨论 |
| 4.1 ARPC5 促进病毒复制 |
| 4.2 ARPC5 通过调控微丝促进病毒复制 |
| 4.3 TRIM62 抑制ARPC5 的表达且与其互作 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.1 鸡传染性贫血 |
| 1.2 马立克病 |
| 1.3 网状内皮组织增生症 |
| 1.4 禽白血病 |
| 1.5 我国家禽免疫抑制病病原感染现状 |
| 2 免疫抑制病病原检测方法的研究概况 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 血清学检测技术 |
| 2.3 分子生物学检测技术 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 毒株来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 样品DNA的提取 |
| 2.4 样品RNA的提取和反转录 |
| 2.5 样品PCR检测 |
| 2.6 数据整理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病原的PCR检测结果 |
| 3.2 感染类型分析 |
| 3.3 不同日龄鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.4 不同品种鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.5 江苏地区鸡2016-2019年免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.6 4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株来源 |
| 1.2 临床样品来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 荧光定量PCR质粒标准品的制备与鉴定 |
| 2.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.6 临床样品的检测和验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒测序鉴定结果 |
| 3.3 质粒标准品的制备 |
| 3.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.6 临床样品的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 发病鸡背景资料及流行病学调查 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测 |
| 2.2 MDV分离培养 |
| 2.3 REV和ALV分离培养 |
| 2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5 致病相关基因的PCR扩增、测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病鸡的组织病变 |
| 3.2 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 REV和ALV分离结果 |
| 3.4 MDV分离结果 |
| 3.5 间接免疫荧光试验 |
| 3.6 致病相关基因的PCR扩增及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 本文第二章120份临床病鸡样品的流行病学背景资料 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡马立克氏病病毒 |
| 1.1.1 火鸡疱疹病毒 |
| 1.1.2 鸡马立克氏病病毒活载体疫苗研究进展 |
| 1.2 新城疫概述 |
| 1.2.1 新城疫病毒 |
| 1.2.2 新城疫病毒流行病学 |
| 1.2.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 第二章 HVT Fosmid粘粒拯救系统的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 疫苗株 |
| 2.1.2 鸡胚和细胞 |
| 2.1.3 主要试剂和实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 HVT扩大培养及基因组提取 |
| 2.2.2 基因组DNA平末端化修饰 |
| 2.2.3 连接和包装 |
| 2.2.4 重组粘粒的鉴定和测序 |
| 2.2.5 亲本株病毒的拯救 |
| 2.2.6 拯救亲本株病毒的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HVT基因组Fosmid文库的构建 |
| 2.3.2 用于病毒拯救的重组粘粒的选择 |
| 2.3.3 拯救病毒rHVT的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 rHVT-NDV-F疫苗株的构建及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 鸡胚和细胞 |
| 3.1.2 疫苗株和质粒 |
| 3.1.3 主要试剂和实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HVT粘粒拯救系统的改造 |
| 3.2.2 表达NDVF基因重组粘粒的构建 |
| 3.2.3 表达NDV F基因重组HVT疫苗株的构建 |
| 3.2.4 rHVT-NDV-F疫苗株PCR鉴定 |
| 3.2.5 rHVT-NDV-F疫苗株目的蛋白表达鉴定 |
| 3.2.6 rHVT-NDV-F疫苗株体外复制能力检测 |
| 3.2.7 重组病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 H4-Kan/ccdb粘粒构建鉴定 |
| 3.3.2 H4-F粘粒的构建鉴定 |
| 3.3.3 rHVT-NDV-F重组病毒的拯救 |
| 3.3.4 rHVT-NDV-F重组病毒PCR鉴定 |
| 3.3.5 rHVT-NDV-F重组病毒目的蛋白表达鉴定 |
| 3.3.6 重组病毒的体外复制动力学鉴定 |
| 3.3.7 重组病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 rHVT-NDV-F重组病毒的免疫保护效力初步评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 疫苗株和病毒 |
| 4.1.2 细胞和雏鸡 |
| 4.1.3 主要实验试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 rHVT-NDV-F重组病毒动物实验分组 |
| 4.2.2 rHVT-NDV-F重组病毒诱导ELISA抗体水平检测 |
| 4.2.3 动物实验攻毒发病情况和排毒检测实验测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 免疫rHVT-NDV-F重组病毒鸡产生抗体水平 |
| 4.3.2 rHVT-NDV-F重组病毒NDV强毒F48E9 株的免疫保护效力评价 |
| 4.3.3 rHVT-NDV-F重组病毒NDV流行株LHLJ/01/06 株的免疫保护效力评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽网状内皮组织增生病及其研究进展 |
| 1.1.1 禽网状内皮组织增生病病毒及其研究进展 |
| 1.1.2 REV的致病机制 |
| 1.1.3 REV感染动物的临诊主要症状及其病理变化 |
| 1.1.4 RE诊断及其防制(治) |
| 1.2 可变剪接及其研究进展 |
| 1.2.1 可变剪接概述 |
| 1.2.2 可变剪接的研究历史 |
| 1.2.3 可变剪接的主要形式 |
| 1.2.4 可变剪接的功能 |
| 1.2.5 可变剪接的产生机制 |
| 1.2.6 可变剪接的调控 |
| 1.2.7 可变剪接的应用与展望 |
| 1.3 microRNA及其研究进展 |
| 1.3.1 microRNA概述 |
| 1.3.2 microRNA-155及其研究进展 |
| 1.3.3 microRNA应用及其展望 |
| 1.4 本项目研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 病毒 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 主要化学试剂和生物制剂 |
| 2.1.5 主要溶液及其配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 制备鸡胚成纤维细胞 |
| 2.2.2 病毒复制 |
| 2.2.3 REV荧光定量检测方法的建立 |
| 2.2.4 REV滴度测定 |
| 2.2.5 REV感染CEFs后可变剪接分析 |
| 2.2.6 REV感染对CEFs中miR-155的影响 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 REV荧光定量检测方法的建立及病毒滴度测定 |
| 3.1.1 REV复制及其检测 |
| 3.1.2 REV荧光定量检测方法的建立 |
| 3.1.3 病毒滴度测定 |
| 3.2 高通量测序结果及其分析 |
| 3.2.1 样本转录组 |
| 3.2.2 可变剪接基因的识别 |
| 3.2.3 可变剪接基因差异表达分析 |
| 3.2.4 差异表达可变剪接基因功能分析 |
| 3.2.5 测序结果的验证 |
| 3.3 miR-155检测及其分析 |
| 3.3.1 REV接毒时间对CEFs中miR-155表达的影响 |
| 3.3.2 REV感染剂量对CEFs中miR-155表达的影响 |
| 3.3.3 转染效率的检测 |
| 3.3.4 细胞活力的检测 |
| 3.3.5 REV感染对CEFs细胞凋亡及其相关酶活性的影响 |
| 3.3.6 REV感染对CEFs细胞周期的影响 |
| 3.3.7 miR-155靶基因验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 REV复制及其验证 |
| 4.2 REV荧光定量PCR检测方法的建立及其应用 |
| 4.3 REV感染对CEFS可变剪接的影响 |
| 4.3.1 禽类病毒对可变剪接的影响 |
| 4.3.2 REV感染CEFs中差异表达可变剪接基因的功能分析 |
| 4.3.3 REV感染所致的可变剪接对CEFs细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 REV感染所致的可变剪接对CEFs细胞周期的影响 |
| 4.3.5 高通量测序结果的进一步验证 |
| 4.4 miR-155对REV感染CEFS的影响 |
| 4.4.1 miRNA在病毒感染中的作用 |
| 4.4.2 miR-155在REV感染CEFs中的变化 |
| 4.4.3 miR-155对CEFs应答REV感染的调控作用 |
| 4.4.4 miR-155对CEFs应答REV感染的调控机制 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）REV感染对HD11和DT40细胞凋亡相关因子表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 REV及其研究进展 |
| 1.1.1 RE的病原学及其生物学特征 |
| 1.1.2 RE流行病学 |
| 1.1.3 REV的流行分布 |
| 1.1.4 REV感染雏鸡临诊主要症状及病理变化 |
| 1.1.5 REV感染雏鸡引起的免疫抑制 |
| 1.1.6 REV与禽类其他病原的混合感染 |
| 1.1.7 RE的诊断 |
| 1.1.8 RE的防治(制)及研究意义 |
| 1.2 细胞凋亡及其研究进展 |
| 1.2.1 细胞凋亡概述 |
| 1.2.2 细胞凋亡的检测方法 |
| 1.2.3 细胞凋亡通路 |
| 1.2.4 细胞凋亡相关基因 |
| 1.2.5 病毒感染与细胞凋亡 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 主要生物制剂及化学试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 常用溶液及其配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试验细胞的培养 |
| 2.2.2 试验分组及被检材料的处理 |
| 2.2.3 检测指标及方法 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 REV RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.1.1 总RNA提取 |
| 3.1.2 REV LTR重组质粒PCR鉴定 |
| 3.1.3 pMD-18T-LTR重组质粒扩增曲线、熔解曲线和标准曲线 |
| 3.2 REV感染HD11和DT40细胞后病毒载量的变化 |
| 3.3 REV感染HD11和DT40细胞后细胞活力变化 |
| 3.3.1 REV感染HD11细胞后细胞活力变化 |
| 3.3.2 REV感染DT40细胞后细胞活力变化 |
| 3.4 REV感染HD11和DT40细胞后细胞线粒体膜电位的变化 |
| 3.5 REV感染HD11和DT40细胞后细胞内Ca~(2+)含量的变化 |
| 3.6 REV感染HD11和DT40细胞后细胞凋亡率的变化 |
| 3.6.1 REV感染HD11细胞后细胞凋亡率的变化 |
| 3.6.2 REV感染DT40细胞后细胞凋亡率的变化 |
| 3.7 REV感染HD11和DT40细胞Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9 m RNA表达变化 |
| 3.7.1 REV感染HD11细胞Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9 m RNA表达变化 |
| 3.7.2 REV感染DT40细胞Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9 m RNA表达变化 |
| 3.8 REV感染HD11和DT40细胞caspase-3酶活性变化 |
| 3.8.1 REV感染HD11细胞caspase-3酶活性变化 |
| 3.8.2 REV感染DT40细胞caspase-3酶活性变化 |
| 3.9 REV感染HD11和DT40细胞Bcl-2和caspase-9蛋白含量变化 |
| 3.9.1 REV感染HD11细胞Bcl-2和caspase-9蛋白含量变化 |
| 3.9.2 REV感染DT40细胞Bcl-2和caspase-9蛋白含量变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 REV感染HD11和DT40细胞后病毒增殖的变化 |
| 4.2 REV感染对HD11和DT40细胞凋亡的影响 |
| 4.2.1 REV感染HD11和DT40细胞后细胞凋亡率的变化 |
| 4.2.2 REV感染对HD11和DT40细胞促凋亡相关因子的影响 |
| 4.2.3 REV感染对HD11和DT40细胞抑凋亡相关因子的影响 |
| 4.3 REV感染对HD11和DT40细胞Ca~(2+)含量和线粒体膜电位的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）REV感染对鸡骨髓源树突状细胞Toll样受体及其信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 禽网状内皮组织增生病及其研究进展 |
| 1.1.1 RE的病原学 |
| 1.1.2 RE的流行病学 |
| 1.1.3 RE患禽临诊主要症状和病理变化 |
| 1.1.4 REV的致病机制 |
| 1.1.5 RE的防治(制) |
| 1.2 树突状细胞及其研究进展 |
| 1.2.1 树突状细胞的发现及其特点 |
| 1.2.2 树突状细胞的免疫应答功能 |
| 1.2.3 树突状细胞与免疫耐受 |
| 1.2.4 树突状细胞的体外培养 |
| 1.3 禽类树突状细胞及其研究进展 |
| 1.3.1 禽类树突状细胞的发现及其特点 |
| 1.3.2 禽类树突状细胞与TLRs |
| 1.3.3 禽类树突状细胞的体外培养 |
| 1.4 本项目研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 REV毒株 |
| 2.1.3 主要生物制剂及化学试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.1.5 主要溶液及其配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鸡骨髓细胞的提取及其处理 |
| 2.2.2 鸡骨髓源树突状细胞的体外诱导培养 |
| 2.2.3 鸡骨髓源树突状细胞表面超微形态观察——扫描电镜法 |
| 2.2.4 鸡骨髓源树突状细胞表面标志物的检测 |
| 2.2.5 鸡骨髓源细胞培养条件的优化 |
| 2.2.6 REV感染鸡骨髓源树突状细胞分子生物学验证 |
| 2.2.7 REV感染对鸡骨髓源树突状细胞成熟的影响 |
| 2.2.8 REV感染鸡骨髓源树突状细胞TLRs及其下游因子m RNA表达的检测 |
| 2.2.9 REV感染鸡骨髓源树突状细胞IL-6、IL-8和IFN-β蛋白含量的检测 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸡骨髓源树突状细胞体外诱导培养及其主要生物学特征 |
| 3.1.1 体外诱导培养的鸡骨髓细胞在光镜下形态特征 |
| 3.1.2 鸡骨髓源树突状细胞表面超微形态特征 |
| 3.1.3 鸡骨髓源树突状细胞表面标志 |
| 3.1.4 培养条件对鸡骨髓源树突状细胞的影响 |
| 3.1.5 鸡骨髓源树突状细胞最优培养条件下细胞生长情况 |
| 3.2 REV感染对鸡骨髓源树突状细胞成熟的影响 |
| 3.2.1 PCR鉴定 |
| 3.2.2 REV感染鸡骨髓源树突状细胞后细胞形态变化 |
| 3.2.3 REV感染鸡骨髓源树突状细胞表面标志变化 |
| 3.3 REV感染鸡骨髓源树突状细胞TLRs及其相关因子m RNA的表达 |
| 3.3.1 REV感染鸡骨髓源树突状细胞TLR3 m RNA表达变化 |
| 3.3.2 REV感染鸡骨髓源树突状细胞TLR7 m RNA表达变化 |
| 3.3.3 REV感染鸡骨髓源树突状细胞TLR21 m RNA表达变化 |
| 3.3.4 REV感染鸡骨髓源树突状细胞My D88 m RNA表达变化 |
| 3.3.5 REV感染鸡骨髓源树突状细胞TRIF m RNA表达变化 |
| 3.3.6 REV感染鸡骨髓源树突状细胞NF-κB m RNA表达变化 |
| 3.3.7 REV感染鸡骨髓源树突状细胞IL-6 m RNA表达变化 |
| 3.3.8 REV感染鸡骨髓源树突状细胞IL-8 m RNA表达变化 |
| 3.3.9 REV感染鸡骨髓源树突状细胞IFN-βm RNA表达变化 |
| 3.4 REV感染鸡骨髓源树突状细胞IL-6、IL-8、IFN-β蛋白含量变化 |
| 3.4.1 REV感染鸡骨髓源树突状细胞IL-6蛋白含量变化 |
| 3.4.2 REV感染鸡骨髓源树突状细胞IL-8蛋白含量变化 |
| 3.4.3 REV感染鸡骨髓源树突状细胞IFN-β蛋白含量变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡骨髓源树突状细胞体外诱导培养方法的建立及培养条件优化 |
| 4.2 REV感染对鸡骨髓源树突状细胞成熟的影响 |
| 4.3 REV感染对鸡骨髓源树突状细胞TLRs及其相关因子的影响 |
| 4.3.1 REV感染对鸡骨髓源树突状细胞TLR3 及其相关因子的影响 |
| 4.3.2 REV感染对鸡骨髓源树突状细胞TLR7、TLR21 及其相关因子的影响 |
| 4.3.3 REV感染对鸡骨髓源树突状细胞IL-6、IL-8和IFN-β的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）鸡circRNA2420-Bcl11b介导细胞凋亡调控ALV-J感染的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 禽白血病研究进展 |
| 1.1.1 禽白血病概况 |
| 1.1.2 禽白血病病毒研究进展 |
| 1.1.3 禽白血病临床诊断 |
| 1.1.4 J亚群禽白血病病毒致病与致瘤机制 |
| 1.1.5 禽白血病的防控措施 |
| 1.2 Bcl11b的研究进展 |
| 1.2.1 BCL(B-cell lymphoma/leukemia)家族 |
| 1.2.2 BCL11B的结构与功能 |
| 1.2.3 BCL11B在血液系统肿瘤中的功能 |
| 1.2.4 BCL11B与其他恶性肿瘤的关系 |
| 1.2.5 家禽中BCL11基因研究进展 |
| 1.3 CircRNA研究进展 |
| 1.3.1 CircRNA形成机制 |
| 1.3.2 CircRNA的生物学功能 |
| 1.3.3 CircRNA与肿瘤的关系 |
| 1.3.4 CircRNA在家禽上的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第2章 ALV-J感染相关转录本及互作关系筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 鸡转录本特征分析 |
| 2.2.2 感染组与非感染组差异表达分析 |
| 2.2.3 ALV-J感染相关差异表达转录本功能注释与富集 |
| 2.2.4 ALV-J感染相关互作网络分析与构建 |
| 2.2.5 ALV-J感染关键转录本验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 鸡转录本特征比较 |
| 2.3.2 ALV-J感染相关差异表达转录本联合分析 |
| 2.3.3 功能富集分析 |
| 2.3.4 ceRNA互作及共表达网络的构建 |
| 2.3.5 ALV-J感染致病致瘤候选转录本鉴定 |
| 第3章 鸡Bcl11b基因克隆、表达及功能初步分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 鸡Bcl11b基因CDS克隆与序列分析 |
| 3.2.2 鸡Bcl11b基因表达规律分析 |
| 3.2.3 鸡Bcl11b基因过表达对细胞活力、凋亡及周期的影响 |
| 3.2.4 鸡Bcl11b基因干扰对细胞凋亡及周期的影响 |
| 3.2.5 Bcl11b在ALV-J感染过程的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 鸡Bcl11b调控ALV-J感染的作用机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 鸡Bcl11b 3'UTR获取 |
| 4.2.2 靶向鸡Bcl11b 3'UTR的miRNAs预测及鉴定 |
| 4.2.3 miRNAs靶向鸡Bcl11b基因参与ALV-J的感染 |
| 4.2.4 circRNA_2420-miRNA-Bcl11b网络关系验证 |
| 4.2.5 鸡Bcl11b在基因组上结合位点分析 |
| 4.2.6 Bcl11b基因调控模式图 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 miRNA靶向Bcl11b调节ALV-J的感染过程 |
| 4.3.2 家禽circRNA成环机制 |
| 4.3.3 circRNA_2420作为ceRNA靶向鸡Bcl11b调节细胞凋亡 |
| 4.3.4 转录因子Bcl11b靶基因分析 |
| 全文结论 |
| 主要创新点 |
| 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受的致病机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 禽白血病病毒概述 |
| 1.1.1 ALVs家族及亚群 |
| 1.1.2 ALVs的结构特征 |
| 1.1.3 ALVs的理化特征 |
| 1.1.4 ALV-J的实验室宿主系统 |
| 1.1.5 ALV-J的致病性 |
| 1.2 禽白血病病毒对免疫系统的损伤及其诱导的免疫耐受 |
| 1.2.1 ALVs对免疫系统损伤的研究进展 |
| 1.2.2 ALV-J诱导的免疫耐受 |
| 1.2.3 与免疫耐受相关的几个概念 |
| 1.3 鸡免疫器官特点及B细胞免疫应答的分子机制 |
| 1.3.1 鸡免疫器官的组成及发育特点 |
| 1.3.1.1 鸡T细胞的发育及分化 |
| 1.3.1.2 鸡B细胞的发育及分化 |
| 1.3.2 B细胞介导的体液免疫及免疫球蛋白产生的分子机制 |
| 1.3.2.1 B细胞介导的体液免疫 |
| 1.3.2.2 免疫球蛋白的结构特点 |
| 1.3.2.3 免疫球蛋产生的分子机制 |
| 1.4 BCR信号转导及Lyn介导B细胞无能和耐受的分子机制 |
| 1.4.1 B细胞抗原受体及BCR信号通路 |
| 1.4.2 Lyn在 BCR信号转导中的正调控及负调控作用 |
| 1.4.3 Lyn介导B细胞无能和免疫耐受的机制 |
| 1.4.3.1 无能B细胞的生物学特征 |
| 1.4.3.2 Lyn介导B细胞无能和免疫耐受的分子机制 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 主要检测试剂及耗材 |
| 2.2 主要缓冲液 |
| 2.3 抗体 |
| 2.4 细胞及病毒 |
| 2.4.1 DF-1 细胞的培养传代与冻存 |
| 2.4.2 DT40 细胞的培养传代与冻存 |
| 2.4.3 鸡B淋巴细胞祖细胞的分选与培养 |
| 2.4.4 细胞的病毒感染 |
| 2.4.5 病毒TCID50的检测 |
| 2.5 主要仪器与设备 |
| 2.6 ALV-J先天感染免疫耐受鸡实验模型的建立 |
| 2.6.1 先天感染模型 |
| 2.6.2 后天感染模型 |
| 2.6.3 ALV-J p27 抗原的检测 |
| 2.6.4 抗ALV-J抗体的检测 |
| 2.7 鸡免疫器官病理组织学观察 |
| 2.8 免疫组化检测 |
| 2.9 免疫球蛋白及相关抗体水平ELISA检测 |
| 2.9.1 鸡血液总免疫球蛋白水平的ELISA检测 |
| 2.9.2 鸡血液抗SRBC抗体及抗MDV抗体水平的ELISA检测 |
| 2.10 B细胞中Lyn的 shRNA干扰 |
| 2.11 流式细胞术检测 |
| 2.11.1 法氏囊内B细胞祖细胞发育和分化的检测 |
| 2.11.2 IgM及IgG细胞比例及B细胞内Ig基因CSR的流式细胞术检测 |
| 2.11.3 B细胞中Lyn及 Syk的磷酸化蛋白的流式细胞术检测 |
| 2.11.4 B细胞Ca2+流的流式细胞术检测 |
| 2.12 细胞增殖的CCK-8 检测 |
| 2.13 荧光定量PCR |
| 2.13.1 RNA的提取及反转录 |
| 2.13.2 荧光定量PCR |
| 2.14 蛋白质免疫印迹 |
| 2.15 统计分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 ALV-J免疫耐受鸡实验模型的建立 |
| 3.2 ALV-J感染鸡免疫器官病变特点 |
| 3.3 ALV-J胚内感染对早期B细胞发育的影响 |
| 3.4 ALV-J胚内感染对鸡体内Ig M型和IgG型 B细胞的影响 |
| 3.5 ALV-J感染对鸡特异性体液免疫应答能力的影响 |
| 3.6 ALV-J胚内感染对生发中心B细胞活化及扩增的影响 |
| 3.7 ALV-J对不同发育阶段B细胞的嗜性 |
| 3.8 ALV-J胚内感染对CD117~+祖 B细胞分化的影响 |
| 3.9 ALV-J对CD117~+祖 B细胞体外增殖的影响 |
| 3.10 ALV-J对CD117~+祖 B细胞体外分化与成熟的影响 |
| 3.11 ALV-J对CD117~+祖 B细胞Ig基因类别转换重组的影响 |
| 3.12 感染型DF-1 细胞中Lyn的蛋白质组学检测结果验证 |
| 3.13 ALV-J感染对法氏囊细胞中Lyn表达水平的影响 |
| 3.14 ALV-J对 B细胞中Lyn的表达水平的影响 |
| 3.15 ALV-J对 B细胞中Lyn磷酸化水平的影响 |
| 3.16 ALV-J感染对鸡法氏囊细胞Lyn及 Syk磷酸化水平的影响 |
| 3.17 Lyn shRNA干扰B细胞中Lyn蛋白表达水平 |
| 3.18 Lyn shRNA干扰B细胞中Lyn及 Syk的磷酸化水平 |
| 3.19 ALV-J感染对B细胞Ca2+流的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 ALV-J先天感染诱导免疫耐受的细胞生物学机制 |
| 4.1.1 B细胞发育障碍与ALV-J感染诱导的免疫耐受直接相关 |
| 4.1.2 祖B细胞克隆无能是ALV-J诱导免疫耐受的重要因素 |
| 4.2 ALV-J诱导B细胞无能的分子机制 |
| 4.2.1 ALV-J感染导致BCR信号转导关键蛋白Lyn异常表达 |
| 4.2.2 ALV-J激活了Lyn在 BCR信号转导中的负调控作用 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 7.致谢 |
| 8.攻读学位期间发表论文情况 |
四、禽类免疫抑制/干扰（论文参考文献）
- [1]REV-SNV对SPF雏鸡RLRs信号通路相关MiRNAs及其靶基因表达的影响[D]. 姜皓. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究[D]. 南福龙. 吉林大学, 2021(01)
- [3]TRIM62调节ARPC5抑制禽网状内皮组织增生症病毒复制的研究[D]. 杨洁. 山东农业大学, 2021
- [4]江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 闫彩虹. 扬州大学, 2020(04)
- [5]表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价[D]. 许曾焜. 中国农业科学院, 2020
- [6]REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响[D]. 高畅. 东北农业大学, 2020(04)
- [7]REV感染对HD11和DT40细胞凋亡相关因子表达的影响[D]. 周放. 东北农业大学, 2020(04)
- [8]REV感染对鸡骨髓源树突状细胞Toll样受体及其信号通路的影响[D]. 张淑君. 东北农业大学, 2020(04)
- [9]鸡circRNA2420-Bcl11b介导细胞凋亡调控ALV-J感染的作用机制[D]. 仇玲玲. 扬州大学, 2020(01)
- [10]J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受的致病机制研究[D]. 何书海. 山东农业大学, 2019(01)