一、人肝癌细胞系HCC-9810的建立及染色体分析（论文文献综述）
王艺舟[1]（2020）在《中华鲟五种组织细胞系建立及青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定》文中研究表明鱼类细胞系作为理想的体外研究模型,已经成为鱼类生物学研究不可或缺的工具,各个物种不同组织特异性细胞系的分离将为该物种生理学、毒理学、病毒学、基因功能分析、种质资源保护及转基因等领域研究提供特异的、基础的、低成本的研究材料。中华鲟（Acipenser sinensis）是鲟属鱼类中个体最大,生活纬度最南的江海洄游性鱼类,由于过度捕捞、筑坝、航运和污染等人为活动导致中华鲟数量急剧减少,已濒临灭绝。此外,由于其体型巨大,生长缓慢,性成熟周期长等生物学特性导致其种群难以恢复。目前对中华鲟的研究主要集中在形态学、资源生态学和生殖生物学等方面,而在细胞生物学方面研究较少。建立中华鲟组织细胞系有两个重要原因:第一,在细胞水平上保护中华鲟种质资源,第二,中华鲟组织细胞系可作为体外研究模型,支持中华鲟细胞遗传学和生物学等方面的研究。本研究建立了青鱼（Mylopharyngodon piceus）鳍条及中华鲟精巢、肌肉、皮肤、肝脏、鳍条5种组织细胞系,分别命名为MPF、AST、ASM、ASSK、ASL和ASF。目前,MPF传至81代,5种中华鲟组织细胞系均传代到60代,6种细胞的适宜生长温度为28℃,均生长在含有10%FBS、10 ng/m Lβ-FGF、鱼血清和鱼类胚胎提取液的DMEM全培养基中,生长状态良好,MPF的细胞类型为上皮样细胞,中华鲟细胞类型主要为成纤维样细胞和上皮样细胞。染色体分析结果显示青鱼MPF染色体众数为48,属于正常的二倍体细胞;中华鲟细胞染色体众数为264,为多倍体细胞。MPF细胞系的线粒体16s r RNA序列分析结果与NCBI中青鱼的16s r RNA序列相似度高于99%。中华鲟细胞系的18s r RNA序列分析结果与NCBI中中华鲟的18s r RNA序列相似度也均高于99%,这些结果证明了细胞系的来源;通过脂质体转染法、杆状病毒转导法和电穿孔法测试了MPF、AST和ASM 3种细胞的转染效率:MPF的脂质体转染法和电穿孔法的瞬时转染效率分别为8%和24%;脂质体转染法和杆状病毒转导法对中华鲟细胞无效而电穿孔法有效,击穿电压200 V并且击穿时间10 ms时,对中华鲟细胞损伤最小且瞬时转染效率为15%。另外,利用睡美人转座子系统成功构建了转基因AST和ASM细胞系。对青鱼细胞系MPF,进行了基因表达检测和病毒敏感性分析,结果显示,在MPF细胞中存在干细胞标记因子nanog和oct4的表达,说明MPF可能为青鱼鳍条成体干细胞系;MPF细胞对鲤春病毒血症病毒（SVCV）病毒敏感,能产生病变效应,且SVCV可在MPF细胞中大量增殖。青鱼鳍条细胞系的建立不仅可作为研究青鱼基因功能和病毒致病机制的体外工具,为大型淡水鱼类的研究提供理想的体外模型,或许还可以为鱼类干细胞相关基因的功能研究提供材料。通过建立中华鲟细胞系,在细胞水平上保护了珍稀物种中华鲟的种质资源,通过筛选出中华鲟细胞最优的外源基因导入方法,使中华鲟细胞成为研究中华鲟基因功能的理想体外模型。生殖细胞的发育是生物生长发育、繁殖延续的一个重要且复杂的过程,对生殖细胞增殖分化的分子学机理的研究一直是生命科学的重要课题。Dazl是DAZ家族的重要成员,是生殖细胞的重要标记基因,其在大部分脊椎动物的两性生殖细胞中特异表达,其编码的RNA结合蛋白在生殖细胞的发育和分化过程中发挥着重要作用。青鱼是我国传统的“四大家鱼”之一,其体型大、生长快、口感好且营养价值高,是我国重要的人工养殖品种,但青鱼性成熟周期长,且人工繁殖难度较高。因此对青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定,为研究青鱼生殖细胞的发育和性腺分化提供重要的工具和参考。本研究通过RACE技术在青鱼中克隆了dazl c DNA,序列全长2013 bp,编码216个氨基酸。蛋白序列比对结果显示,其含有RRM（RNA recognition motif）保守区域和一个DAZ重复序列,青鱼Dazl与斑马鱼（Danio rerio）的Dazl序列相似度最高,为85%。通过构建青鱼Dazl重组表达载体诱导Dazl蛋白并制备了兔抗Dazl多克隆抗体,经过验证Dazl抗体可以特异性的识别青鱼Dazl原核表达蛋白、卵巢组织内源蛋白和真核表达蛋白。在组织中,dazl只在青鱼的性腺中表达,组织原位杂交和免疫荧光结果均表明dazl在青鱼的早期卵母细胞中表达,主要分布在I、II和III期卵母细胞的细胞质中。在胚胎发育过程中,dazl在早期胚胎中表达量较高,随着胚胎的发育表达量逐渐降低,到原肠期几乎检测不到表达。整胚原位杂交结果显示dazl在早期胚胎的各个细胞中均表达。通过Tail-PCR技术扩增出1612 bp的青鱼dazl基因5’侧翼区启动子序列,并构建启动子不同区段的荧光素酶报告系统psi-CHECK-1612、psi-CHECK-938和psi-CHECK-303。将它们分别转染到SG3、CIK和SKOV3细胞,利用双荧光素酶报告系统鉴定了青鱼dazl基因核心启动子区域,结果表明-850～+88区域存在青鱼dazl基因的重要调控元件。由于青鱼生殖周期较长,且胚胎卵膜薄,不适合进行基因功能研究,因此我们选取模式生物青鳉（Oryzias latipes）作为替代对象,利用CRISPR/Cas9系统对青鳉dazl基因进行敲除,结果表明青鳉dazl的缺失可能会导致青鳉胚胎中原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）的缺失,在F0代成鱼中发现3尾雌性性腺缺失,结果表明dazl可能参与性腺的形成和发育。本研究中通过分析青鱼dazl基因的表达模式,表明青鱼dazl是与生殖细胞形成和发育相关的重要因子,结合dazl在其他鱼类中的表达及青鳉dazl的敲除结果,为后期青鱼dazl基因功能及其生殖细胞的研究提供参考。综上所述,第一,本研究建立了珍稀濒危物种中华鲟不同组织的细胞系,并对其基本生物学特性进行分析,发现最适于中华鲟细胞的转染方法,建立转基因中华鲟细胞系,在细胞水平上保护了中华鲟的种质资源,并为中华鲟基因功能的研究提供了理想的体外工具。第二,本研究建立青鱼鳍条组织细胞系,对其生物学特性进行了分析,为将来在青鱼细胞系上开展基因功能和病毒致病机制研究奠定了基础。第三,本研究克隆和鉴定了青鱼生殖细胞标记基因dazl,其在胚胎发育的早期和性腺的生殖细胞中表达,另外,青鳉dazl基因的缺失会导致PGCs的缺失,表明其可能在生殖细胞的形成和发育过程中起到关键作用。
刘世旭[2]（2019）在《稀有鮈鲫卵细胞系的建立及其对草鱼呼肠孤病毒增殖特性研究》文中研究表明草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）属于水生呼肠孤病毒属,是水生呼肠孤病毒属中危害最大的病原之一,也是中国分离的第一株水生动物病毒,可感染草鱼和青鱼,严重时造成80%-100%的死亡率。稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）是一种小型的实验鱼类,研究证明稀有鮈鲫对部分草鱼呼肠孤病毒株很敏感,感染GCRV后,鱼体会表现出明显的出血病症状,甚至死亡。草鱼出血病流行病学调查显示,目前国内有三种基因型GCRV,基因II型为主要流行株型,GCRV-Ⅱ型毒株存在不能产生细胞病变,病毒增殖量低,常用草鱼细胞携带病毒等问题,亟需建立无病原携带且对GCRV-Ⅱ敏感的细胞系进行GCRV-Ⅱ型病毒致病机制、疫苗研发研究。本研究主要包括两部分内容:1.稀有鮈鲫卵细胞系的建立:本文采用胰蛋白酶消化法进行稀有鮈鲫卵组织的体外培养,并通过对培养液配方条件的优化成功地进行了稀有鮈鲫卵细胞的原代培养和继代培养,该细胞命名为GrE（Gobiocypris rarus eggs,GrE）。结果显示,GrE细胞的较适宜培养液为含有10%胎牛血清（FBS）的M199培养液,较适宜培养温度为28℃。细胞的贴壁、生长和分裂状态良好,GrE细胞为典型的上皮样细胞;经连续继代培养后,已成功建立了稀有鮈鲫卵细胞系,现已继代培养至第70代;染色体分析结果显示,GrE染色体众数为2n=66,核型为2n=30m+24sm+10t+2st,而稀有鮈鲫鱼体的染色体数目为2n=50,GrE细胞的染色体数目已发生改变,表明GrE细胞已发生突变,为永生化细胞系。GrE细胞系细胞经液氮冻存复苏后仍保持其原有细胞形态,其贴壁生长状态和增殖速度也与冻存前无差异。2.稀有鮈鲫卵细胞的应用:（1）将特定浓度的不同水生动物病毒,包括I、II型草鱼呼肠孤病毒（GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ）、鲤春病毒血症病毒（SVCV）、大口黑鲈虹彩病毒（LMBV）,蛙虹彩病毒（FV3）)等接种至稀有鮈鲫卵细胞,接种后观察细胞产生细胞病变（CPE）情况,并用PCR进行定性检测。结果显示,GrE接种这五种病毒后,除接种GCRV的细胞外,其余细胞内均出现明显的CPE,且RT-PCR/PCR均检测出特异性目的条带,说明GrE细胞可用于上述常见病毒的分离和鉴定。此外,对于未产生明显CPE的GCRV接种组,通过间接免疫荧光进一步验证GrE细胞对GCRV-Ⅰ和GCRV-Ⅱ的敏感性,两种基因型的GCRV的滴度分别为105.59.59 TCID50/ml、106.47.47 TCID50/ml。（2）本研究进一步比较了GrE和草鱼肾脏细胞CIK对GCRV的敏感性,将初始滴度为103 TCID50/ml的GCRV-Ⅰ和GCRV-Ⅱ同时接种于GrE和CIK细胞,GCRV-Ⅰ感染实验共7d,GCRV-Ⅱ感染实验14d,计算两种不同基因型GCRV在GrE和CIK细胞中的病毒拷贝数。结果显示,在GrE和CIK两种细胞中,GCRV-Ⅰ型的最高病毒拷贝数出现在第4 d,分别为1.45×105拷贝/μL（GrE）、1.26×104拷贝/μL（CIK）,而GCRV-Ⅱ病毒拷贝数分别在感染CIK 7 d（约3.37×104拷贝/μL）和GrE 12 d（约2.25×105拷贝/μL）后达到高峰。（3）将GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ分别感染GrE细胞并传代20代,第1代和20代GCRV-Ⅰ都未能使稀有鮈鲫出现任何出血病的临床症状,组织病理切片结果显示,与阴性对照组无明显区别。前后两个代次的GCRV-Ⅱ注射感染稀有鮈鲫3-5d,鱼体出现了典型的出血病临床症状。鱼体各组织出现比较明显的病理变化,其中脑和肝组织的细胞间隙变大,有的细胞出现破裂,脾脏和肾脏组织中出现明显的棕黄色噬铁血红素中心,肠道毛细血管出血严重并伴随有肠绒毛破碎、形状不完整的现象。本研究成功构建稀有鮈鲫卵细胞系GrE,确定了细胞系的较适宜生长条件,并对细胞系的生长特性、细胞形态、染色体形态及在水生动物病毒上的应用进行了初步研究,研究结果表明,GrE可用于多种常规水生动物病毒的分离和培养。GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ均可以在GrE中增殖,与草鱼肾脏细胞CIK相比,GrE更适合GCRV-Ⅱ的增殖。两种基因型GCRV感染稀有鮈鲫后,通过临床症状观察,组织病毒载量测定,组织病理分析,表明GCRV-Ⅱ在GrE细胞上传代,至少20代毒力保持稳定。本研究中建立的GrE细胞可以用于流行基因型草鱼呼肠孤病毒的流行病学、致病机理、以及疫苗研发等相关研究。
周颖星[3]（2018）在《超高灵敏流式检测技术在人类端粒长度的单染色体水平的应用》文中研究表明端粒是染色体末端的DNA串联重复序列和端粒结合蛋白组成的复合体,能够防止染色体末端的降解、融合和重排,从而维持染色体的独立性、完整性和稳定性。由于在DNA复制过程中,DNA聚合酶无法完整的复制滞后链DNA,在通常的DNA复制中染色体末端会发生序列丢失（即末端复制问题）,因此在正常的细胞衰老过程中,伴随着细胞分裂次数增多,DNA多次复制,染色体末端的端粒最终会逐渐缩短。当端粒逐渐缩短,端粒维持染色体的稳定功能受到破坏,细胞将会出现衰老的表现;而当端粒持续性缩短直至长度不足3 kb时,大量细胞将会走向死亡,机体则表现为衰老或早衰,在此时极少数的细胞端粒酶活性被激活,转化为无限增殖的癌细胞。由于端粒的长度存在高度的异质性,不同染色体的端粒缩短程度是不一样的,而在整体水平分析大量端粒长度其结果也是所有端粒长度的平均值,无法揭示少量的非常短的端粒的存在,而正是这些短端粒的存在才是触发衰老和癌变的关键;此外,在不同物种之间端粒长度存在很大的差异,人类端粒长度（0.5-18 kb）远小于实验室常用动物模型（25-150kb）,因此,亟需一种能够在单个染色体水平精确、简单、快速、高通量地检测人类端粒长度和短端粒比率的方法。目前端粒长度主要分析方法是末端限制片段分析法（terminal restriction fragment,TRF）、定量 PCR（quantitative PCR,qPCR）、STELA（single telomere length analysis）、Q-FISH（quantitative fluorescence in situ hybridization）和Flow-FISH,但是还没有一种方法能够快速、准确地检测群体中关键的短端粒的长度和比率。本论文拟用实验室自行研发的超高灵敏流式检测装置,依赖于其高灵敏、多参数的检测性能,建立一种单个染色体水平的端粒长度的检测方法,并将该方法推广至临床样品的研究中。本论文主要包括以下内容:第一章主要对端粒的结构和功能,端粒与人类多种疾病的关系进行介绍,并简介现有的端粒长度分析方法和超高灵敏流式检测技术（high sensitivity flow cytometry,HSFCM）。本章的最后简要介绍了本论文的选题思路以及研究内容。第二章为单颗粒水平染色体检测的超高灵敏流式分析方法的建立。我们以实验室常用永生细胞作为实验对象,通过优化提取过程中的各种条件,建立一种简单易行、普适性强、质量高的染色体悬液制备方法;并结合核酸染料PI和Picogreen对染色体进行标记,利用HSFCM实现了单个染色体的流式核型分析（利用流式细胞仪分析染色体的数目和大小）;通过利用荧光显微镜对所提取HeLa细胞的染色体的结构直接进行观察;结合流式核型分析结果中荧光峰的中位值和相应染色体DNA含量的线性关系,采用Matlab软件对HeLa细胞的染色体流式核型分析数据进行理论模拟。结合这三种手段,验证所制备染色体悬液的纯度以及染色体的结构完整性。第三章为端粒长度的单染色体水平HSFCM测定方法的建立。采用所设计能特异识别端粒重复序列的肽核酸探针,通过对杂交条件的优化,建立在悬液中对染色体的端粒进行荧光原位杂交的方法。,采用HSFCM对单个染色体的散射和绿色荧光信号进行检测,结合AlexaFluor488当量已知的荧光标准球所绘制的荧光强度和AlexaFluor488当量的标准工作曲线,将单个染色体端粒的荧光信号强度转换为单个染色体的端粒长度,实现端粒长度的单染色体水平测定。第四章为端粒长度检测的HSFCM与传统分析方法的对比。我们选择五种永生细胞系（HeLa、A549、HEK293T、SMMC-7721 和 Hep G2）作为实验对象,分别进行HSFCM和三种主要的传统分析方法（TRF、qPCR和Q-FISH）,并将四种分析方法的性能进行对比,从而验证我们所发展的在单染色体水平测定人类染色体端粒长度的HSFCM方法的准确性和可靠性。第五章为临床急性和慢性髓系白血病患者外周血样本的单染色体水平端粒长度测定。通过优化外周血单核细胞的提取和体外培养的条件,我们实现了对外周血中淋巴细胞的体外培养,并将所建立的HSFCM方法应用于临床外周血淋巴细胞端粒长度的检测。通过对比健康人和白血病不同阶段患者的短端粒含量,考察其是否能用于疾病治疗效果的评估;通过对比急性白血病和慢性粒细胞白血病加速或急变期患者的短端粒含量,考察短端粒是否能作为疾病急变的一个指标。第六章为特异染色体端粒长度的单染色体水平测定。我们搭建了配备有488 nm和642 nm两个激光器的超高灵敏流式检测装置,利用分别靶向端粒重复序列和特异（X和18号染色体的α-卫星DNA序列）染色体的两种肽核酸探针,实现了对特异染色体的指认及其端粒长度的同时分析,对比了X和18号染色体之间的端粒长度差异。我们还发现HeLa细胞中存在X染色体的亲本同系物（即拥有相同的α-卫星DNA序列但拷贝数不同的两种X染色体）。第七章对本论文的研究工作进行总结,并在此基础上对将来的进一步研究思路和方向进行展望。
李志明[4]（2018）在《多芯片联合解析ZCCHC13和PLCXD3基因在无精症、肝细胞癌中的表观遗传调控机理》文中指出睾丸组织高表达的基因不仅对生殖细胞的生物学过程非常重要,而且与多种肿瘤的发生密切相关,其中最有代表性的就是癌睾抗原。miRNA和DNA甲基化是调控基因表达的两个主要的表观遗传因素。为了发现睾丸组织高表达基因在miRNA和DNA甲基化方面的表观遗传调控机制,本课题以非梗阻性无精症（Non-obstructive azoospermia,NOA）和梗阻性无精症（Obstructive azoospermia,NOA）患者的睾丸组织为样本,首先运用基因表达谱、miRNA表达谱和DNA甲基化表达谱芯片筛查了差异表达的基因、miRNA和甲基化位点,然后通过荧光定量PCR技术对芯片结果进行了实验验证,发现两个功能未知的基因PLCXD3和ZCCHC13,它们在生精功能正常的OA睾丸组织中呈强阳性表达,而在精子生成障碍的NOA睾丸组织中未见表达,推测二者对精子生成有重要作用。接着结合生物信息学预测信息,在生殖细胞系和肿瘤细胞系中对着两个基因的靶miRNA,以及ZCCHC13基因的甲基化调控进行了深入研究。本课题的主要研究结果如下:1.建立了 NOA和OA的睾丸组织的基因表达谱、miRNA表达谱和DNA甲基化表达谱,发现OA睾丸组织的基因表达和表观遗传组数据（miRNA和DNA甲基化）与NOA明显不同。2.对差异表达基因和差异表达miRNA进行了关联分析,构建了 miRNA-基因调控网路,软件预测和实验验证结果都证明PLCXD3与miR-34c-3p,ZCCHC13与miR-369-3p有负调控关系。3.在小鼠、OA和NOA的睾丸组织中检测了 PLCXD3和ZCCHC13蛋白定位,首次发现小鼠和OA患者（生精功能正常）的睾丸有PLCXD3和ZCCHC13蛋白的强免疫阳性信号,而在NOA睾丸组织中表达非常弱;正常肝脏组织的PLCXD3和ZCCHC13基因的表达水平都非常低。4.对差异表达基因和差异表达DNA甲基化位点进行了关联分析,发现ZCCHC13基因启动子存在甲基化修饰位点,甲基化转移酶抑制剂诱导的去甲基化能上调其mRNA和蛋白的表达。5.ZCCHC13基因启动子DNA低甲基化修饰是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）组织和细胞系过表达ZCCHC13蛋白的表观遗传原因,而ZCCHC13过表达能激活AKT/ERK/c-MYC信号通路,上调周期蛋白CDK1和CKD4蛋白表达,进而促进肿瘤细胞增殖。综上所述,本课题以睾丸组织为样本建立了芯片联合分析的方法,应用该方法筛选得到了两个关键基因PLCXD3和ZCCHC13,以及分别对应的靶miRNA:miR-34c-3p和miR-369-3p。此外,在生殖细胞和肿瘤细胞中发现ZCCHC13表达水平受DNA甲基化修饰的影响,基因组的去甲基化可以上调ZCCHC13蛋白表达。本研究首次在生殖细胞和肿瘤细胞中揭示了 PLCXD3和ZCCHC13的表观遗传调控方式,为探索无精症和癌症的分子机制提供了重要的实验依据。
马娜[5]（2016）在《树鼯肝细胞永生化方法的建立及ITH6.1细胞系特性分析》文中指出肝脏疾病是一系列严重危害人类健康的疾病,合适的动物模型仍然为许多药物筛选和疫苗开发所急需。相对于小鼠、大鼠等啮齿类动物,树鼩是一种与灵长类亲缘关系更为接近的小型动物,因此具有其独特的应用价值。由于与人相似的肝炎药物靶向基因以及能够感染以人类为特定宿主的嗜肝性病原体（如肝炎病毒等）,树鼩肝细胞具备了与人肝细胞很多相似的特点。然而,树鼩这一研究模型还有许多不成熟、需要被优化的地方。例如种群不均一、实验周期长,常常会导致实验结果偏差较大、可重复性差。同时,利用原代树鼩肝细胞进行研究也受到诸多限制,因为肝脏是一种处于分化末端的器官,即使经过较为费时费力的操作获得原代肝细胞,细胞在体外培养数天后就会死亡,很难进行耗时较长的基因导入或基因编辑等实验研究。由于目前还没有建立树鼩永生化肝细胞系的先例,因此本研究以建立永生化树鼩肝细胞系为目的,通过向体外树鼩原代肝细胞导入外源性基因,成功建立了树鼩肝细胞永生化的方法。随后,本研究对一株永生化树鼩肝细胞系ITH6.1 （immortalized tupaia hepatocyte 6.1）进行了特性分析,研究显示：该细胞有着较强的增殖能力,连续传代超过100次后,仍保持相对稳定的细胞特性。进一步对ITH6.1进行基因测序、蛋白表达、生化指标等特性分析,结果显示了ITH6.1具有典型的树鼩肝细胞特性。同时致瘤性实验等安全性检测也提示了该细胞系具有较好的生物安全性。树鼩永生化细胞系的建立不但减少了实验动物的使用量,提供了一种更为稳定的实验研究对象,同时也将为树鼩动物肝病模型的优化提供更为方便快捷的体外预分析系统。
张艳玲[6]（2015）在《CD34+肝癌干细胞的分离、鉴定和来源探讨》文中研究说明肝癌是世界上最常见的第五大恶性肿瘤,第三大常见的癌症致死原因;目前肝癌的主要治疗手段为手术治疗、肝移植、肝动脉化疗栓塞术、射频消融治疗,但各治疗手段均有局限性,因而肝癌患者的生存率低下,结合肝癌的发病机制研究进而开发新的治疗方法成为当下肝癌治疗的迫切需要。研究人员一直试图阐明肝癌的发生机制以及细胞起源,近年肿瘤干细胞研究进展对肿瘤的发生发展及治疗有了新的认识。肿瘤干细胞理论认为:肿瘤组织中仅有一小部分（<1.0%）肿瘤细胞有致瘤性,绝大多数肿瘤细胞没有或仅有有限的增殖能力,这小部分肿瘤细胞因具有永生不死、持续分裂、分化的能力,称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的发现突破了人类对肿瘤发生及复发的认识,另外针对肿瘤干细胞的治疗也成为未来肿瘤治疗的希望。因此发现不同种类肿瘤其相应的肿瘤干细胞使肿瘤的干细胞治疗成为可能,同时对肿瘤的早期诊断和治疗意义深远。那么分离和鉴定特定肿瘤的干细胞成为目前医学研究的热点之一,这也是本课题的重点研究内容。随着肿瘤干细胞研究工作开展,近年来认为可能产生肿瘤干细胞的决定因素有:遗传不稳定性、微环境、细胞融合和水平基因转移。目前许多研究认为肿瘤干细胞源自正常成体干细胞,肿瘤干细胞与正常成体干细胞有很多相似的特性,而且二者共享很多信号通路,如果正常成体干细胞长期处在致癌微环境下,DNA损伤修复无法及时有效完成,关键基因异常、失活或信号通路失调等等,这些因素都可能致使正常的成体干细胞转化为肿瘤干细胞。但目前对肿瘤干细胞的来源探讨,仅局限于研究人员各自领域,其实验结果仅仅是真正的全面的肿瘤干细胞形成机制中的一部分。肿瘤干细胞起源还有待于进一步大量而全面的研究。许多研究表明肿瘤干细胞表面有其独特的标志物,如何利用这些特有的标志物分离和鉴定肿瘤干细胞,是将肿瘤干细胞应用于肿瘤诊断和治疗的首要问题,同时肿瘤干细胞的形成机制也是现代医学待解决的问题。因此,本课题选择了恶性程度高的肝癌细胞作为研究对象,分离和鉴定CD34阳性的肝癌干细胞,并探讨了其形成的可能机制。本课题由两部分研究组成,第一部分是CD34+肝癌干细胞（LCSCs）的分选、鉴定及如何将分选的CD34+LCSCs体外培养,第二部分是CD34+LCSCs来源的探讨。第一部分人肝癌干细胞分选、鉴定和培养常规分离PLC肝癌细胞（Primary Liver Carcinoma,PLC/PRF/5）,结合CD34抗体流式筛选CD34+肝癌细胞。分选后的CD34+肝癌细胞,分别进行体外培养、免疫组化、PCR、成瘤性及体外分化实验来鉴定是否具有肝癌干细胞（LCSCs）的形态学和生物学特性。用建立的方法体外培养,维持其肝癌干细胞特性。1、CD34+PLC分选及肿瘤干细胞特性检测课题组前期工作通过流式细胞仪检测发现人肝癌细胞系PLC中CD34+细胞为3%到6%,高于HepG2等其它6个肝癌细胞系。因此用CD34抗体结合CD44、CD133、OV6和EpCAM4个抗体标记分选得到CD34+PLC细胞、CD34-PLC细胞、8 个 CD34+PLC 亚群（CD34+CD133±、CD34+CD44±、CD34±EpCAM±和CD34+OV6±）,以及4个双阳标记CD34+亚群细胞（CD34+CD133+、CD34+CD44+、CD34+EpCAM+和CD34+OV6+）体外培养后子代细胞分选出来的4组细胞（CD34-CD133+、CD34-CD44+、CD34-EpCAM+和CD34-OV6+）分别注射到NOD/SCID/IL2RG小鼠皮下;祖细胞PLC也同时注射相同的小鼠模型,各个实验组在3个月内形成的小鼠移植性肿瘤。结果显示CD34+PLC仅100个细胞即可成瘤;而在相同的成瘤时间,CD34+PLC各组仅需1000个细胞成瘤,而PLC和CD34-PLC需要100000或更多细胞数。接种100个细胞数即可成瘤,表明CD34+PLC如同LCSCs具有非常强的致瘤性,提示CD34+具有LCSCs一样的功能。对CD34+PLC形成的移植瘤进行鉴定。从不同的CD34+PLC中分选出了 8个CD34+亚群及其4个子细胞群均能形成人肝癌（Human Liver Cancer,HLC）移植瘤,并分为3个表型肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、混合型肝细胞-胆管细胞癌（Combined Hepatocellular Carcinoma,CHC）和肝胆管型肝癌（Cholangiocarcinoma,CC）。这是第一次证实CD34+细胞具有CSC的特性能自我更新,能分化行成HLC移植瘤;也是第一次发现LCSCs在动物模型中生成三种表型HLC,说明CD34+PLC具有多能性;而12个细胞亚群都是同一个来源,都能独立地形成肿瘤,说明他们可能是肿瘤起始细胞（TICs）。免疫组化HE染色显示CD34+PLC移植瘤具有典型的人肝癌组织学特征。免疫荧光结果表明人移植瘤组织表达人肝特异性蛋白:白蛋白、甲胎蛋白、αl抗胰蛋白酶和EpCAM。分离的CD34+PLC可以在小鼠成纤维饲养层细胞（Mouse Embryo Fibroblasts,MEFs）上克隆扩增自我更新,表明它们具有干细胞的特性。CD34+PLC表达肝干细胞标志物以及公认的肿瘤干细胞标记。以上结果提示分选的 CD34+PLC 为 LCSCs。2、CD34+LCSCs体外培养目前分选CSC的方法较多,但还鲜有CSCs体外长期培养的稳定可靠方法。为了研究CD34+LCSCs体外培养条件和传代后细胞形态及功能,把刚分选获得的CD34+LCSCs单个细胞,置于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层细胞上培养,经过7-10天的培养,形成一个圆形克隆细胞,每个克隆形态各异,说明具有多态性。CD34+LCSCs不仅可以在MEF饲养层细胞传代和培养,也可以冷冻保存和复苏。把CD34+LCSCs培养到第12代后冻存和复苏,细胞形态与未冻存的相似。CD34+LCSCs还可以在ECM肝癌干细胞专用平板上培养,可以去除MEFs饲养层细胞后短期培养,依然保持细胞形态。为了评价CD34+LCSCs克隆细胞的成瘤能力,分别用刚分选出的CD34+LCSCs细胞和培养的CD34+LCSCs克隆细胞（第5,18代）裸鼠皮下注射,成瘤所需时间和细胞数没有差别。免疫组化HE染色显示CD34+LCSCs克隆细胞形成的移植瘤具有典型的人肝癌组织学特征。将MEFs上培养的CD34+LCSCs细胞克隆与特异性标记的抗体免疫染色,实验结果显示干细胞标记物:CD117（c-kit）和SOX2;正常肝干细胞标志物:AFP、CK19和OV6;及肿瘤干细胞标志物:CD44、EpCAM、CD133和CD31,CD34+LCSCs均有表达。SOX2与干细胞的多能性和自我更新特性相关,免疫组织化学在CD34+LCSCs克隆细胞中检测出SOX2表达,提示SOX2在CD34+LCSCs高表达,并是调节LCSCs的重要因素。为了评估在CD34+LCSCs克隆细胞体外诱导分化结果,在第0、4、9、和13天分化后的收获细胞。定量PCR评价肝（癌）标志物白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）和CK7,CK19;肝癌干细胞标志物CD133、CD44、CD90和EpCAM,以及CD34和CD31基因的表达。除了CD34下降、CD133（day4）和CD90（day9）没有显着升高,其他基因的表达均比day0天显着增加（p<0.05）,其中EpCAM、CD44持续高表达,ALB、AFP、CK19、CK7和CD31的表达随时间增加（p<0.05）。本研究用CD34标记从人肝癌细胞PLC中成功分离CD34+PLC,经鉴定其为LCSCs;并发现HLC可能由CD34+细胞形成,从而揭示出人类肝肿瘤起源的多样性。本研究成功地在体外培养和扩增CD34+LCSCs,在饲养层细胞上长期培养CD34+LCSCs并保持其致瘤性和多潜能性,并且在我们实验条件下CD34+LCSCs可以像正常干细胞如ESC和iPSC那样在体外培养和扩增。第二部分CD34+LCSCs来源探讨1、CD34+LCSCs表达髓单核细胞标志物、肝干细胞标志物及CD45通过qPCR在CD34+LCSCs中检测到肝胆干/祖细胞（HSPC）的标志物OV6;单核/巨噬细胞标记物CD14、CD68、甲胎蛋白（AFP）、溶菌酶和α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）。一般正常造血干/祖细胞不表达单核细胞基因;然而,CD34+LCSCs共表达CD68、CD14、CD31等巨噬细胞的抗原,表明肝干/祖细胞标记物和粒细胞标记物在同一细胞中表达,这说明CD34+LCSCs是表达来源于肝胆干/祖细胞（HSPC）和单核细胞（单核细胞/巨噬细胞）两种不同的细胞的混合表型。免疫组化检测CD34+LCSCs形成的人肝癌移植瘤,结果显示共表达Hep PAR1和CD68,CK19和CD68,AFP和CD68,以及αα1-AT和CD31。表明肝（癌）标记物和单核细胞标记物标记在同一细胞中表达,为杂交细胞表现出俩个亲本细胞表型。再次提示CD34+LCSCs可能是HSPC与单核细胞融合形成的细胞。免疫荧光检测CD34+LCSCs共表达OV6和CD45、CD45及巨噬细胞抗原。CD34+LCSCs形成的移植瘤细胞表达肝细胞癌标志物和CD45（Hep Par1和CD45,CK19和CD45）,这表明CD34+LCSCs可能来自一个CD34+造血前体。2、PLC细胞和CD34+LCSCs移植瘤表现巨噬细胞特征吞噬实验检测CD34+LCSCs移植瘤细胞、PLC、阳性对照组TIB和阴性对照组293T对大肠杆菌（E.coli）的吞噬能力,结果证实CD34+LCSCs移植瘤细胞和PLC具有吞噬大肠杆菌（E.coli）的能力（p<0.05）;通过qPCR检测CD34+LCSCs移植瘤细胞、PLC,实验结果表明CD34+LCSCs移植瘤细胞、PLC表达细胞因子IL-1b、IL-6、IL-12A、IL-18、TNF-α、CSF1（M-CSF）和趋化因子IL-8、CCL2、CCL5（p<0.05）,而且INF-γ、IL-4和LPS会促进这些因子表达（p<0.05）,其中TNF-α、CSF1、IL-12A、CCL2、CD68和CD14在CD34+LCSCs移植瘤中表达增强（p<0.05）,表现出巨噬细胞的特性。3、CD34+LCSCs移植细胞和PLC的人肝表型通过qPCR检测CD34+LCSCs移植瘤细胞、PLC和HepG2,与HepG2相比CD34+LCSCs移植瘤细胞和PLC表达Ⅰ和Ⅱ期代谢酶CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6、UGT1A8、UGT1A10和Ⅲ期的转运蛋白、葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）（p<0.05）,其中CYP2C9、CYP2C19、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A8、UGT1A10和Glut2在CD34+LCSCs移植瘤细胞中表达更显着（p<0.05）。说明CD34+LCSCs移植细胞和PLC具有人肝表型。4、基因组学、细胞遗传学分析两种不同的细胞类型融合产生的杂交异核体细胞最初包含两种类型细胞的遗传因素的和细胞器。由此进行了CD34+LCSCs染色体细胞遗传学分析。结果显示,CD34+PLC中平均模态数（50-60）的染色体为82%,13%的CD34+PLC细胞染色体数目在90-116的范围;因此猜测,染色体数目从50-60的细胞是LCSCs的后代,是LCSCs衍生物在增殖或分化过程中额外的核被挤出。在PLC中平均模态数（50-60）的染色体为76%,12%的PLC细胞染色体数目在90-116的范围,与CD34+PLC相类似分布。由于PLC在其基因组中整合乙肝病毒（HBV）DNA,检测是否CD34+LCSCs也整合HBV表面抗原基因（S）,核心基因（C）,聚合酶基因（P）和HBVDNA连结。PCR发现他们在PLC和CD34+LCSCs中相似,而在Hep G2细胞是阴性。测序发现HBV DNA连接的DNA片段序列有3个碱基对不同（TCT代替CTC）,PCR和测序确定这三个突变在CD34+LCSCs和PLC,表明PLC肝癌形成可能是起源于CD34+LCSCs。通过以上探讨CD34+肝癌干细胞的来源的研究表明,CD34+LCSCs表现出肝干/祖细胞（HSPC）和单核细胞的混合表型,而且CD34+LCSCs形成的人肝癌移植瘤也显示肝癌与骨髓单核细胞混合表型。这表明,CD34+LCSCs可能是融合细胞。实验结果显示在同一细胞中共存两种不同类型的细胞的细胞功能,细胞分泌表达肝细胞来源的白蛋白同时也表达细胞因子和趋化因子表达和具有单核细胞的吞噬作用,证明LCSCs是通过融合所形成的。CD34+LCSCs表达CD45,展示它的起源似乎是从造血前体。所以本部分研究的结论是,CD34+LCSCs可能是由CD34+造血细胞来源的髓样细胞融合形成的中间体。综合本课题的两部分研究,取得了以下成果:1、从人肝癌细胞PLC中成功分离CD34+PLC,经鉴定其为肝癌干细胞（LCSCs）;2、可分化形成肝细胞癌三种表型,发现HLC可能由CD34+细胞形成,从而揭示出人类肝肿瘤起源的多样性。成功地体外培养和扩增CD34+LCSCs,证明CD34+LCSCs可以像正常干细胞如ESC和iPSC在体外无限的培养和扩增。3、发现一个肝癌来源于CD34+造血前体干细胞,报道人类癌症干细胞可能是融合形成。CD34+LCSCs的系列实验研究结果,丰富了肝癌干细胞理论,探讨肿瘤的发生和发展的机制,并确定肿瘤干细胞特定的生物标志物,可用于肝癌早期诊断及药物对CSC疗效评价和新药开发,对肝癌治疗的临床研究提供重要依据。
张璐[7]（2012）在《维吾尔族妇女宫颈癌细胞株的建立与生物学特性的研究》文中提出目的：建立维吾尔族妇女宫颈癌细胞株并观察其生物学特性，为维吾尔族妇女宫颈癌的病因学研究及临床治疗途径提供实验材料。方法：无菌切除维吾尔族妇女子宫颈低分化鳞状细胞癌的手术标本，用酶消化法体外培养，连续传代稳定生长后，测定细胞活力绘制细胞生长曲线。采用光镜、电镜观察细胞形态并进行细胞周期和染色体分析。检测裸鼠接种后的成瘤率。用免疫荧光和免疫组化法测定细胞株肿瘤标记物（CK17、CD44）、（CK14、Ki-67、Vimentin）的表达情况。结果：酶消化法体外培养获得维吾尔族妇女宫颈癌原代细胞，持续培养12个月，传代70代，细胞呈多边形，上皮样细胞排列贴壁生长，无接触抑制，生长稳定，群体倍增时间为51.91小时，集落形成率为32.5%/15.6%。超微结构显示，细胞表面有较多突起或微绒毛，胞浆内有大量的杆状、棒状体和较典型的桥粒结构，核异型性明显。染色体数目在32-97条之间，大多数在54-86条之间（60.33%），结构为人类染色体。裸鼠接种可形成移植瘤，组织病理形态学和患者原始肿瘤一致。细胞株肿瘤标记物（CK17、CD44、Ki-67、Vimentin）呈阳性表达，CK14呈阴性表达。结论：通过酶消化法体外培养建立的维吾尔族妇女宫颈癌细胞株具有人宫颈鳞状上皮细胞癌的特点，与原发癌保持相同的生物学特性，体外连续传代培养12个月，细胞形态及生长周期恒定，可望成为一个稳定的细胞系。
王涛[8]（2010）在《来源于肝癌门静脉癌栓细胞系（CSQT-2）的建立及其生物学特性研究》文中研究指明[引言]原发性肝细胞癌（以下简称肝癌或HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一,其最显着的特点是发生转移及形成门静脉癌栓（以下简称PVTT）,术后高转移、高复发率是其死亡率居高不下的重要原因。经过多年的努力,肝癌患者的5年生存率已经得到了提高。然而,原发性肝癌伴门静脉癌栓患者的预后却依然十分凶险,其1年生存率亦不容乐观,且术后转移、复发率较前者更高。目前对于PVTT的研究已经引起人们的广泛重视,针对PVTT的病理意义、形成机制、生物学特性等方面也做出了一系列探索性研究,并提出过不同的假说,但是,遗憾的是,种种假说都不能对PVTT的形成机制作出合理的解释。其主要原因在于,对PVTT进行实验研究不能直接在人体进行,需要建立便于体外研究的PVTT细胞模型,然而,纵观国内外已建立的肝癌相关细胞系,目前尚无合适的PVTT细胞模型可以被用以研究PVTT的发生机制及其生物学特性。鉴于此,建立一株具有明确成瘤性和转移性的来源于人肝癌门静脉癌栓的细胞系在研究PVTT相关机制方面具有十分重要的意义。[目的]建立一株来源于人肝癌门静脉癌栓的细胞系并对其成瘤性、转移性及其他生物学特性进行研究,以探讨肝癌伴门静脉癌栓的相关机制。[方法]1.来源于人肝癌门静脉癌栓细胞系CSQT-2的建立利用PVTT新鲜组织块进行皮下移植瘤模型构建、完整组织块原位移植法、皮下移植瘤原代培养等一系列方法,建立一株来源于人肝癌门静脉癌栓的细胞系。2.CSQT-2的生物学特性研究通过各种体内外实验方法,如细胞形态学采用光镜观察；超微结构采用电镜观察；MTT法测细胞生长期曲线；流式细胞仪分析细胞周期；DNA组成及分析细胞表面标志物；皮下成瘤实验观察CSQT-2成瘤能力；生物荧光标记法观测细胞转移能力等对CSQT-2的生物学特性进行研究。[结果]通过皮下移植瘤模型构建、完整组织块原位移植法、皮下移植瘤原代培养等一系列方法成功建立了一株来源于人门静脉癌栓的PVTT细胞系,并命名为CSQT-2。其生物学特性如下：扫描电镜显示CSQT-2细胞表面存在微绒毛,透射电镜显示大多数的CSQT-2细胞含有不规则的桥粒,线粒体,核糖体和细胞核；细胞生长曲线显示CSQT-2细胞在体外倍增时间约为48h,DNA周期分析：G0／G1为51.51%,G2／M为13.82%,S为34.67%。皮下成瘤实验提示,CSQT-2最低成瘤细胞数量级为103,成瘤时间为6周。将CSQT-2细胞系的皮下移植瘤接种到裸鼠肝脏后,经病理切片分析,可观察到镜下门静脉癌栓的形成。细胞表面标志物的表达实验显示CSQT-2第5代细胞表达CD133阳性比例为8.1%,CD90阳性比例为4.1%,然而,上述比例在细胞传至60代后分别变为0.2%和0.4%。与CD133和CD90表达情况相比,EpCAM的结果则恰恰相反,其阳性比例则由24.8%变为99.8%；投射电镜检测结果提示CSQT-2细胞无支原体等污染。[结论]1.经肝癌门静脉癌栓新鲜组织块进行皮下移植瘤模型构建、完整组织块原位移植法、皮下移植瘤原代培养等一系列方法培养的CSQT-2细胞系能够稳定传代,具有无限增殖能力。2. CSQT-2细胞系具有相对特殊的生物学特性,主要表现为：①细胞生长较迅速,这可能与其凋亡率较低和细胞周期较短有关；②SQT-2细胞表现出较强的成瘤能力；③SQT-2具有形成PVTT的能力,经原位移植瘤种植肝脏后,可观察到镜下癌栓；④CSQT-2在细胞表面标志物的表达方面具有自己的特点,可以作为实验材料应用于PVTT相关肿瘤干细胞方面的研究。因此,CSQT-2是一株来源于PVTT的具有较强成瘤性和转移性的PVTT细胞系,可以应用于肝癌伴门静脉癌栓相关机制的研究。
李苏宜[9]（2010）在《重组人生长激素干预GHR不同表达水平人肝癌细胞的实验研究》文中研究表明目的：体外环境下,观察重组人生长激素（recombinant human growth hormone, rhGH）对生长激素受体（growth hormone receptor, GHR）不同表达状态的人肝癌细胞系增殖、凋亡及其胞膜表面GHR密度变化的影响,对与肝癌细胞同环境人脐静脉内皮细胞（ECV304）增殖的影响,并初步探索相关机理。方法：利用体外培养的Bel-7402、HepG2、SMMC7721、QGY-7701、Bel-7405和HCCLM3六种肝癌细胞,和人脐静脉内皮细胞株ECV304,用免疫细胞化学法检测人肝癌细胞系表面GHR的表达。然后把各肝癌细胞系分三组：对照组、rhGH浓度50ng/ml的rhGH,组和250ng/ml的rhGH2组；通过ELISA法、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、流式细胞术及荧光染色等手段,观察rhGH对肝癌细胞细胞生长、凋亡、细胞周期比例、IGF-1分泌等的影响；再设立ECV304单独培养组、SMMC-7721/ECV304共培养组和Bel-7402/ECV304共培养组。用上述干预方法/和联合贝伐单抗干预,描绘ECV304细胞生长曲线和流式细胞仪检测ECV304周期比例。分别单独培养SMMC-7721、Bel-7402,用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）测定肝癌细胞VEGF mRNA表达和蛋白分泌情况；最后选取HepG-2、SMMC7721、和QGY-7701,每株细胞四种处理：未处理组,50ng/mlrhGH干预组,100ng/mlrhGH干预组,200ng/mlrhGH干预组。采用流式、放射性受体分析方法检测rhGH处理后细胞膜表面GHR的表达情况的变化情况。同时行四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染色、ELISA法分析不同浓度rhGH对人肝癌细胞系的细胞生长、增殖、IGF-I分泌等的影响。结果：Bel-7402、HepG2细胞过表达GHR,与对照组相比,rhGH体外明显促其分裂增殖,IGF-1分泌量增加（P<0.05）,且与rhGH浓度无关。SMMC7721可疑表达GHR, QGY-7701 Bel-7405和HCCLM3细胞均不表达GHR, rhGH对其细胞分裂增殖及IGF-1分泌变化均无明显影响（P>0.05）；与Bel-7402,SMMC7721分别共培养ECV304细胞与单独培养的ECV304细胞相比,生长速度加快,倍增时间缩短,S期升高（P<0.05）。与对照组比较,rhGH促Bel-7402的VEGF mRNA表达及蛋白分泌水平均增加,并且与ECV304共培养时细胞S期比例显着升高,且呈rhGH浓度依赖（P<0.05）,却未引起细胞株SMMC-7721发生相应变化（P>O.05）。贝伐单抗封闭VEGF,所有实验组均出现ECV304增殖参数下调（P<0.05）,联合高浓度rhGH无法逆转；50、100、200ng/ml rhGH干预后,流式细胞术检测HepG2细胞胞膜表面GHR密度,荧光强度较未处理组明显增加（P<0.05）,放射性受体分析法检测其胞膜表面GHR位点数分别为：8.4350±0.2396、9.3957±0.5143、8.3297±0.3133（10-3/cell）,较空白对照组7.5137±0.5352（10-3/cell）明显增加（P<0.05）；与未处理组比,rhGH干预细胞株SMMC7721及QGY-7701,均未引起胞膜表面GHR密度变化。结论：体外环境下,rhGH可致过量表达GHR的人肝癌细胞株生长加速、提高其胞膜GHR密度,促其效应因子IGF-I、VEGF的分泌增加,并促其同环境生长的血管内皮细胞生长加速；对不表达或微弱表达GHR人肝癌细胞则无类似作用。
胡华生[10]（2009）在《来源于肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系的建立及其生物学特性研究》文中提出背景原发性肝细胞癌（以下简称肝癌或HCC）是我国第二位癌症杀手,尽管经过百余年的努力,肝癌临床已有长足进步,但总体而言,其预后仍然险恶。肝癌预后不佳的一个重要原因是不少病人在初次诊断时肿瘤就已经侵犯门静脉并形成门静脉癌栓（以下简称PVTT）。门静脉癌栓一旦形成,不仅阻断了肠道血液的回流,加重门静脉高压,导致消化道出血、腹水形成,影响肝脏营养的获得,还导致肝内肿瘤的播散,等等。这是肝癌临床的一大难题,而其实质则是肝癌侵袭转移特性的表现。已有证据表明,肝癌侵袭转移潜能并非癌症晚期所独有,不少小的肝癌也可出现血管癌栓,导致手术切除后早期复发转移。因此,研究肝癌门静脉癌栓,是肝癌临床与基础研究的一个重要问题。不解决癌栓问题,就难以改善肝癌病人的预后。因而深入研究肝癌门静脉癌栓的发病机制、生物学特性,实现对肝癌及门静脉癌栓的有效防治具有重要的意义。但是,对肝癌及门静脉癌栓进行实验研究不能直接在人体进行,需要建立便于体内研究肝癌的肝癌动物模型和体外研究肝癌的肝癌细胞系,因此细胞系在肿瘤理论和应用研究上具有十分重要的价值。由于肿瘤的异质性和复杂性,不同组织来源的细胞,其一些特性和针对性可能不尽相同,所以建立来源于门静脉癌栓的肝癌细胞系对于深入研究门静脉癌栓具有重要意义。目的建立来源于门静脉癌栓的肝癌细胞系,并对其生物学特性进行分析,为研究门静脉癌栓形成机制提供实验材料。方法第一部分:来源于门静脉癌栓的人肝癌细胞系CSQT-1的建立胶原酶消化法对活体人肝癌标本及门静脉癌栓标本进行原代培养;采用挑取克隆细胞岛扩大培养、自然纯化法行单一肝癌细胞纯化;光学显微镜观察细胞生长情况;胰蛋白酶法消化传代培养细胞;采用慢冻和快融进行细胞的冻存和复苏。第二部分:人肝癌细胞系CSQT-1的生物学特性鉴定细胞形态学观察采用光镜观察;超微结构用电镜观察;胎盘蓝染色计数检测冻存后复苏存活率;细胞计数法测定贴壁率;MTT法测细胞生长期曲线;流式细胞仪分析细胞周期和DNA组成;常规制备染色体标本,拍照分析核型;克隆形成实验检测细胞克隆形成率;裸鼠皮下接种CSQT-1细胞悬液,接种后观察成瘤情况,计算异种移植率;透射电子显微镜鉴定细胞系的污染情况。第三部分:构建人肝癌门静脉癌栓裸鼠模型及细胞系CSQT-2的建立和特点分析将人肝癌门静脉癌栓新鲜组织接种到裸鼠肝脏包膜下,形成移植瘤,然后利用移植瘤过继传代到裸鼠肝脏,经过5次传代后,移植瘤生长比较稳定。取裸鼠移植瘤,采用胶原酶消化法以及挑取克隆细胞岛扩大培养、自然纯化法行单一肝癌细胞纯化新建细胞系。对该新建细胞系进行生物学特性分析,将裸鼠成瘤的肝脏用石蜡包埋后制成标本,并使用HE染色后观察有无裸鼠门静脉镜下微癌栓的出现。结果第一部分:细胞原代培养早期,生长比较不稳定,10代以前细胞传代培养时需要较高的接种密度,而且细胞倍增时间不同。到第15代时细胞生长已比较稳定。细胞呈上皮样,大小不一,以多角形、多边形为主,占90%以上。细胞在高密度时（>2×106/mL）可见重叠及堆积生长。传代时间一般为2-3天。第二部分:CSQT-1细胞生物学特性鉴定利用人肝癌门静脉癌栓新鲜组织块进行原代培养起来的细胞系CSQT-1,扫描电镜显示细胞表面丰富微绒毛,细胞大小不等,直径在10-20um之间,透射电镜下见细胞以不规则型为主,细胞间有桥粒紧密连接等,有少量连接复合;细胞间有形成腺结构及条索结构倾向,可形成类似胆小管结构;细胞质丰富,有大量糖原颗粒形成糖原湖样结构;线粒体、粗面内质网较发达,有丰富的游离核糖体;细胞长满瓶底后,有重叠现象细胞失去接触抑制生长核质比例倒置等。冻存后复苏成活率为95%。细胞生长曲线显示上皮样恶性肿瘤生长特性,细胞群体倍增时间为48h,4h后贴壁率已超过90%,细胞软琼脂中生长,克隆形成率为20%。DNA周期分析:G0/G1为64%,G2/M为19%,S为10%。染色体众数以亚四倍体为主。细胞培养上清液AFP阴性,HBsAg阴性。CSQT-1细胞能在裸鼠中的成瘤。透射电镜检CSQT-1细胞无支原体污染。第三部分:通过裸鼠皮下移植瘤及外科原位接种的方法建立了人肝癌门静脉癌栓裸鼠皮下移植瘤模型和人肝癌门静脉癌栓原位移植模型,并且在该肝脏肿瘤组织中成功培养出CSQT-2细胞系。通过对该细胞系进行核型分析及光电镜分析显示其起源于人肝癌门静脉癌栓组织,并且从其成瘤的肝脏中找到了镜下门静脉微癌栓的证据。结论1.由人肝癌门静脉癌栓组织培养的CSQT-1细胞系和通过裸鼠原位移植瘤培养的CSQT-2细胞系均能稳定生长,具有无限生长的能力。该细胞系保持了来源组织的一些特性,AFP和HBsAg阴性,细胞间有形成腺结构及条索结构倾向。2.来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系和其他人肝癌细胞系相比,有其不同的生物学特性,主要表现为:①直接来源于人肝癌门静脉癌栓组织或者裸鼠原位移植瘤;②生长较迅速,贴壁快,细胞倍增时间分别为48h和36h;③AFP阴性,而大多数人癌细胞系的AFP为阳性。④一定数量的细胞种植于裸鼠后能形成肿瘤,且肿瘤随着时间生长迅速;⑤生物学特性稳定,对不同代细胞的生长特性、肿瘤标记物和与肝癌干细胞标记物CD133阳性率检测结果,未显示有明显变化。⑥来源于人门静脉癌栓的细胞系也具有在裸鼠形成门静脉癌栓的能力。因此,CSQT-1及CSQT-2是两株新建的来源于肝癌门静脉癌栓的人肝癌细胞系,是体外研究肝癌门静脉癌栓形成及防治的一个良好模型。本课题创新点及潜在应用价值建立了来源于门静脉癌栓的肝癌细胞系并对其生物学特性进行了分析,在文献上尚未见相关的报道,该细胞系为体外研究肝癌门静脉癌栓形成机制提供了实验材料。
二、人肝癌细胞系HCC-9810的建立及染色体分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人肝癌细胞系HCC-9810的建立及染色体分析（论文提纲范文）
（1）中华鲟五种组织细胞系建立及青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细胞培养的研究进展 |
| 1.1.1 鱼类细胞培养的进程 |
| 1.1.2 鱼类细胞培养的方法 |
| 1.1.3 鱼类细胞所需要的培养条件 |
| 1.1.4 鱼类细胞的鉴定 |
| 1.1.5 鱼类细胞系的应用 |
| 1.2 生殖细胞的发育 |
| 1.2.1 鱼类生殖细胞发育的相关因子 |
| 1.2.2 鱼类生殖细胞特异表达基因 |
| 1.3 dazl基因研究进展 |
| 1.3.1 DAZ基因家族的结构和特征 |
| 1.3.2 DAZ家族成员的进化关系 |
| 1.3.3 DAZ家族的相关研究 |
| 1.3.4 鱼类中dazl的表达与功能研究 |
| 1.4 真核启动子 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 系统简介 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 中华鲟五种组织细胞系的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 中华鲟细胞的原代培养 |
| 2.2.4 中华鲟细胞的传代培养 |
| 2.2.5 中华鲟细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.6 中华鲟细胞生长曲线的测定 |
| 2.2.7 中华鲟细胞的染色体分析 |
| 2.2.8 中华鲟细胞18srRNA基因分析 |
| 2.2.9 中华鲟细胞系转染 |
| 2.2.10 中华鲟转基因细胞的构建 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 中华鲟细胞的原代培养 |
| 2.3.2 中华鲟细胞的传代培养 |
| 2.3.3 中华鲟细胞的冻存和复苏 |
| 2.3.4 中华鲟细胞生长曲线测定 |
| 2.3.5 中华鲟细胞染色体数和核型分析 |
| 2.3.6 中华鲟细胞18SrRNA分析 |
| 2.3.7 中华鲟细胞转染和转基因细胞系的建立 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 青鱼鳍条细胞的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 青鱼鳍条细胞的原代培养 |
| 3.2.4 青鱼鳍条细胞的传代培养 |
| 3.2.5 青鱼鳍条细胞的冻存与复苏 |
| 3.2.6 青鱼鳍条细胞最适生长条件选择 |
| 3.2.7 青鱼鳍条细胞的染色体分析 |
| 3.2.8 青鱼鳍条细胞分子鉴定 |
| 3.2.9 青鱼鳍条细胞免疫荧光分析 |
| 3.2.10 青鱼鳍条细胞脂质体转染和电转效率分析 |
| 3.2.11 SVCV病毒感染实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 青鱼鳍条细胞的原代培养和传代培养 |
| 3.3.2 青鱼鳍条细胞的冻存和复苏 |
| 3.3.3 青鱼鳍条细胞最适的生长条件 |
| 3.3.4 青鱼鳍条细胞的染色体分析 |
| 3.3.5 青鱼鳍条细胞的分子鉴定 |
| 3.3.6 青鱼鳍条细胞的脂质体转染和电转效率分析 |
| 3.3.7 青鱼鳍条细胞的病毒测试 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 青鱼dazl基因克隆及表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 青鱼dazl基因克隆 |
| 4.2.4 序列比对分析 |
| 4.2.5 青鱼Dazl抗体的制备与验证 |
| 4.2.6 通过sqPCR分析dazlmRNA在不同组织及胚胎发育时期的表达 |
| 4.2.7 通过qRT-PCR定量分析dazlmRNA在不同发育时期胚胎中的表达 |
| 4.2.8 利用原位杂交技术分析dazlmRNA在组织和胚胎发育过程中的分布 |
| 4.2.9 Western blot分析Dazl蛋白在不同组织及胚胎发育不同时期的表达 |
| 4.2.10 免疫组化研究Dazl蛋白在卵巢组织中的空间分布 |
| 4.2.11 青鱼Dazl的亚细胞定位 |
| 4.2.12 青鱼dazl的启动子的扩增 |
| 4.2.13 青鳉dazl基因的的敲除 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 青鱼dazl基因克隆及序列分析 |
| 4.3.2 青鱼Dazl多克隆抗体的制备与验证 |
| 4.3.3 青鱼dazl基因在成体组织中的表达分析 |
| 4.3.4 青鱼dazl在胚胎发育过程中的表达分析 |
| 4.3.5 青鱼Dazl的亚细胞定位 |
| 4.3.6 青鱼dazl启动子克隆 |
| 4.3.7 青鱼dazl启动子活性分析 |
| 4.3.8 青鳉dazl基因的敲除及对青鳉PGCs形成的分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 本论文主要研究结果及创新点 |
| 本论文主要的研究结果 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 引物表 |
| 附录一 引物表(续表) |
| 附录二 质粒图谱 |
| 附录三 发表论文 |
| 致谢 |
（2）稀有鮈鲫卵细胞系的建立及其对草鱼呼肠孤病毒增殖特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鱼类细胞培养发展概况 |
| 1.2 鱼类细胞培养技术的分类 |
| 1.2.1 原代细胞培养的组织取材方法 |
| 1.2.2 细胞培养方法 |
| 1.3 鱼类细胞培养所需的条件 |
| 1.4 鱼类细胞培养应注意的问题 |
| 1.5 鱼类细胞的应用 |
| 1.5.1 病毒学 |
| 1.5.2 免疫学 |
| 1.5.3 环境毒理学 |
| 1.5.4 基因组学 |
| 1.5.5 鱼类肿瘤研究 |
| 1.5.6 鱼类胚胎工程 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 稀有鮈鲫卵细胞系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂和器材 |
| 2.1.3 稀有鮈鲫原代卵细胞(GrE)的获得和培养 |
| 2.1.4 稀有鮈鲫卵细胞的传代培养 |
| 2.1.5 较适宜培养条件的确定 |
| 2.1.6 染色体分析 |
| 2.1.7 细胞18sRNA分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 稀有鮈鲫卵细胞的原代培养和传代培养 |
| 2.2.2 较适宜培养条件的确定 |
| 2.2.3 染色体分析 |
| 2.2.4 细胞18sRNA分析 |
| 2.3 讨论与分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 稀有鮈鲫卵细胞系的应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂和器材 |
| 3.1.3 病毒接种和鉴定 |
| 3.1.4 RNA提取 |
| 3.1.5 PCR反应 |
| 3.1.6 GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ的滴度测定 |
| 3.1.7 间接免疫荧光试验 |
| 3.1.8 GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ的敏感性比较 |
| 3.1.9 荧光定量PCR实验 |
| 3.1.10 GCRV毒力的稳定性 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 GrE细胞的病毒感染谱 |
| 3.2.2 GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ的滴度测定 |
| 3.2.3 GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ的敏感性比较 |
| 3.2.4 GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ在GrE中的毒力稳定性 |
| 3.3 讨论与分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（3）超高灵敏流式检测技术在人类端粒长度的单染色体水平的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 染色体的端粒结构和功能简介 |
| 1.1.1 端粒的发现 |
| 1.1.2 端粒的结构和功能 |
| 1.2 端粒长度检测的重要性 |
| 1.2.1 端粒和心血管疾病 |
| 1.2.2 端粒和老化 |
| 1.2.3 端粒和癌症 |
| 1.3 端粒长度的现有分析方法 |
| 1.3.1 末端限制片段分析法(terminal restriction fragmentation, TRF) |
| 1.3.2 基于定量PCR的技术(quantitative PCR,qPCR) |
| 1.3.3 单链端粒长度分析(single telomere length analysis,STELA) |
| 1.3.4 Q-FISH (quantitative fluorescence in situ hybridization) |
| 1.3.5 Flow-FISH |
| 1.4 超高灵敏流式检测技术(high sensitvity flow cytometry, HSFCM) |
| 1.5 本论文选题思路以及研究内容 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 单颗粒水平染色体检测的超高灵敏流式分析方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器与设备 |
| 2.2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 染色体提纯方法的建立 |
| 2.3.2 HSFCM与传统流式细胞仪应用于单颗粒水平染色体分析的散射检测对比 |
| 2.3.3 单颗粒水平染色体荧光检测的核酸染料选择 |
| 2.3.4 染色体纯度和结构完整性的荧光显微镜表征及流式数据的理论模拟验证 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 端粒长度的单染色体水平HSFCM测定方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 仪器与设备 |
| 3.2.2 实验材料与试剂 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 端粒重复序列的特异性肽核酸探针设计 |
| 3.3.2 单染色体水平端粒信号的HSFCM检测初探 |
| 3.3.3 肽核酸探针杂交条件的优化 |
| 3.3.4 HSFCM和传统流式细胞仪应用于单染色体水平端粒的荧光检测对比 |
| 3.3.5 基于荧光微球的单颗粒水平荧光强度与Alexa Fluor 488荧光当量的标准工作曲线的建立 |
| 3.3.6 单染色体水平端粒长度的HSFCM测定 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 端粒长度检测的HSFCM与传统分析方法对比 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 仪器与设备 |
| 4.2.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 五种永生细胞系染色体端粒长度及短端粒比率的单染色体水平HSFCM测定 |
| 4.3.2 TRF实验条件优化及测定结果 |
| 4.3.3 qPCR实验条件优化及测定结果 |
| 4.3.4 Q-FISH实验条件优化及测定结果 |
| 4.3.6 多种端粒长度分析方法的优劣对比 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 临床急性和慢性髓系白血病患者外周血样本的单染色体水平端粒长度测定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 仪器与设备 |
| 5.2.2 实验材料与试剂 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 外周血单核细胞(PBMCs)提取条件的优化 |
| 5.3.2 PBMCs体外培养条件的优化 |
| 5.3.3 PBMCs端粒长度及短端粒比率的定量分析 |
| 5.3.4 各类慢性髓系白血病患者端粒长度及短端粒比率的测定 |
| 5.3.5 慢性髓系白血病患者(加速或急变期)和急性白血病患者端粒长度及短端粒比率的对比 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 第六章 特异染色体端粒长度的单染色体水平测定 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 仪器与设备 |
| 6.2.2 实验材料与试剂 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 双激光HSFCM的仪器性能表征 |
| 6.3.2 染色体特异性肽核酸探针的设计 |
| 6.3.3 特异染色体端粒长度的双荧光检测 |
| 6.3.4 HeLa和SMMC-7721细胞X和18号染色体端粒长度的比较 |
| 6.3.5 与Flow-FISH和Q-FISH的结果对比 |
| 6.4 本章小结 |
| 6.5 参考文献 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 7.3 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）多芯片联合解析ZCCHC13和PLCXD3基因在无精症、肝细胞癌中的表观遗传调控机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词及中英文对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 无精症的分类 |
| 1.1.1 精子生成 |
| 1.1.2 OA的病因,诊断和治疗 |
| 1.1.3 NOA的病因,诊断和治疗 |
| 1.2 精子生成和癌症的关系 |
| 1.2.1 癌睾抗原的发现 |
| 1.2.2 癌睾抗原的表达 |
| 1.3 表观遗传学在疾病中作用 |
| 1.3.1 DNA甲基化 |
| 1.3.2 miRNA |
| 1.3.3 组蛋白修饰 |
| 1.4 立项背景 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂药品和仪器设备 |
| 2.1.1 主要试剂药品 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 病人样本收集 |
| 2.3 组织学实验方法 |
| 2.4 高通量芯片实验方法 |
| 2.5 分子生物学实验方法 |
| 2.6 细胞生物学实验方法 |
| 第3章 miRNA表达谱和基因表达谱联合分析方法的建立 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 总RNA提取和检测 |
| 3.1.2 miRNA表达谱芯片结果和PCR验证 |
| 3.1.3 基因表达谱芯片结果和PCR验证 |
| 3.1.4 联合分析miRNA表达谱和基因表达谱的数据 |
| 3.2 结果讨论 |
| 第4章 miRNA-靶基因验证 |
| 4.1 实验结果 |
| 4.1.1 miR-34c-3p抑制PLCXD3基因的mRNA和蛋白表达 |
| 4.1.2 miR-369-3p抑制ZCCHC13基因的mRNA和蛋白表达 |
| 4.2 结果讨论 |
| 第5章 DNA甲基化和基因表达谱联合分析方法的建立 |
| 5.1 实验结果 |
| 5.1.1 基因甲基化芯片结果 |
| 5.1.2 联合分析DNA甲基化和基因表达谱的数据 |
| 5.2 结果讨论 |
| 第6章 ZCCHC13基因甲基化修饰与NOA病理机制的相关性研究 |
| 6.1 实验结果 |
| 6.1.1 ZCCHC13基因高甲基化抑制蛋白表达 |
| 6.1.2 ZCCHC13调控AKT/ERK/c-MYC信号通路 |
| 6.1.3 甲基化失调抑制生殖细胞的增殖 |
| 6.2 结果讨论 |
| 第7章 肝癌组织ZCCHC13基因低甲基化上调蛋白表达 |
| 7.1 实验结果 |
| 7.1.1 肝癌组织和细胞高表达ZCCHC13蛋白 |
| 7.1.2 ZCCHC13重组蛋白表达、纯化及ZCCHC13抗体的检测 |
| 7.1.3 肝癌组织和细胞ZCCHC13基因呈低甲基化修饰 |
| 7.1.4 肝癌细胞ZCCHC13基因去甲基化上调mRNA和蛋白表达 |
| 7.1.5 ZCCHC13蛋白过表达促进肝癌细胞生长 |
| 7.2 结果讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文及学术成果 |
| 项目支持 |
（5）树鼯肝细胞永生化方法的建立及ITH6.1细胞系特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一节 绪论 |
| 一、树鼩 |
| 1. 树鼩的分类地位 |
| 2. 树鼩原代肝细胞模型在嗜肝病毒研究中的应用 |
| 二、肝细胞的永生化策略 |
| 三、本课题的研究目的和意义 |
| 第二节 树鼩原代肝细胞的分离、培养和鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 细胞株 |
| 3. 主要试剂 |
| 4. 主要耗材 |
| 5. 主要仪器设备 |
| 6. 灌注用实验器材准备 |
| 二、实验方法 |
| 1. 树鼩的麻醉 |
| 2. 树鼩的固定 |
| 3. 从股静脉处注射肝素,进行抗凝处理 |
| 4. 两步灌注法获取树鼩原代肝细胞 |
| 5. 主要溶液的配制 |
| 6. 台盼蓝染色计算肝细胞存活率 |
| 7. 树鼩原代肝细胞(Primary tupaia hepatacyte,PTH)形态学观察 |
| 8. 树鼩原代肝细胞的传代、冻存和复苏试验 |
| 9. 对分离获得的细胞进行PAS(Periodic Acid-Schiff stain)染色鉴定 |
| 10. 对分离出的细胞进行油红O染色鉴定 |
| 11. 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence,IFA)检测PTH6的SV40TAg和Alb表达 |
| 12. Western Blot检测PTH6中SV40TAg、Alb的表达 |
| 三、实验结果与分析 |
| 1. 树鼩原代肝细胞的产量及细胞存活率 |
| 2. 树鼩原代肝细胞的形态学特征 |
| 3. 树鼩原代肝细胞不易传代、冻存和复苏 |
| 4. 树鼩原代肝细胞的功能鉴定 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三节 永生化树鼩肝细胞系ITH6.1的建立和特性分析 |
| 一. 实验材料 |
| 1. 病毒 |
| 2. 细胞系 |
| 3. 质粒与载体 |
| 4. 抗体 |
| 5. 试剂盒 |
| 6. 主要试剂 |
| 7. 实验耗材 |
| 8. 仪器设备 |
| 二、实验方法 |
| 1. 携目的基因的慢病毒载体的包装 |
| 2. 含SV40TAg基因重组慢病毒感染树鼩原代肝细胞 |
| 3. ITH6细胞的传代、冻存和复苏 |
| 4. 有限稀释法挑选单克隆细胞株 |
| 5. ITH6.1细胞形态学观察 |
| 6. ITH6.1的PAS染色鉴定 |
| 7. ITH6.1油红O染色鉴定 |
| 8. 间接免疫荧光法(IFA)检测ITH6.1的SV40TAg和Alb表达 |
| 9. Western blot检测ITH6.1的SV40TAg、Alb表达 |
| 10. ITH6.1肝细胞细胞功能基因的RT-PCR分析 |
| 11. ITH6.1的生长曲线的绘制(计数法) |
| 12. ITH6.1培养上清白蛋白、尿素氮、转氨酶测定 |
| 13. ITH6.1种属来源鉴定实验 |
| 14. PTH6和ITH6.1的STR分型 |
| 15. ITH6.1染色体核型分析 |
| 16. 实时定量PCR方法测定不同代次ITH6.1的T/S值 |
| 17. ITH6.1的病毒易感性实验 |
| 18.主要洛液配制 |
| 三.实验结果与分析 |
| 1. PTH6经慢病毒感染后的传代、冻存后复苏 |
| 2. 通过有限稀释法筛选获得ITH6的亚克隆细胞株：ITH6.1 |
| 3. 永生化树鼩肝细胞ITH6.1的形态特征 |
| 4. 永生化树鼩肝细胞ITH6.1中可以检测到SV40TAg的表达 |
| 5. ITH6.1中检测到肝细胞特异功能蛋白白蛋白的表达 |
| 6. ITH6.1的PAS染色鉴定 |
| 7. ITH6.1的油红O染色鉴定 |
| 8. ITH6.1细胞的RT-PCR检测 |
| 9. ITH6.1的细胞生长曲线(计数法) |
| 10. ITH6.1细胞培养上清液白蛋白、尿素氮、转氨酶的测定 |
| 11. ITH6.1细胞的种属鉴定 |
| 12. PTH6与ITH6.1在中国树鼩的8个STR位点上的基因分型结果相同 |
| 13. ITH6.1染色体分析 |
| 14. ITH6.1端粒相对长度随着细胞传代次数增加逐渐缩短 |
| 15. ITH6.1的病毒易感性研究 |
| 四. 讨论 |
| 五. 小结 |
| 第四节 永生化树鼩肝细胞系ITH6.1的安全性研究 |
| 一. 实验材料 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 细胞系 |
| 3. 细胞培养基 |
| 4. 实验耗材 |
| 二. 实验方法 |
| 1. 细胞接种裸鼠前的存活率测定 |
| 2. 裸鼠致瘤实验 |
| 3. ITH6.1对阿昔洛维的敏感性实验 |
| 4. ITH6.1的回复性实验 |
| 三. 实验结果与分析 |
| 1. ITH6.1不会使裸鼠成瘤 |
| 2. ITH6.1对阿昔洛韦敏感 |
| 3. ITH6.1被EGFP-Cre-Ad感染后SV40TAg的表达逐渐降低 |
| 四. 讨论 |
| 五. 小结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 主要缩略词表 |
| 附录Ⅱ 常用溶液配方 |
| 致谢 |
| 研究生简历 |
| 已发表文章 |
| 博士期间待发表SCI文章 |
（6）CD34+肝癌干细胞的分离、鉴定和来源探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.1 肿瘤干细胞分选、鉴定及来源探讨概况 |
| 1.2 肿瘤干细胞的生物学特征 |
| 1.3 肝癌干细胞 |
| 1.3.1 肝癌的临床特点 |
| 1.3.2 肝癌干细胞研究现状 |
| 1.4 肝癌干细胞分离和成瘤性 |
| 1.4.1 侧群细胞 |
| 1.4.2 运用多个细胞表面分子标记相结合 |
| 1.4.3 细胞成球 |
| 1.5 肝癌干细胞临床意义 |
| 1.5.1 分子靶向治疗 |
| 1.5.2 分化治疗 |
| 1.5.3 抗体治疗 |
| 1.6 肝癌干细胞研究中存在的问题 |
| 第一部分 CD34~+肝癌干细胞分选鉴定和体外培养 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 1.1.4 主要实验仪器和设备 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 实验步骤 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.1.1 肝癌细胞等常规复苏和传代培养 |
| 1.3.1.2 饲养层细胞 |
| 1.3.1.3 人胚胎干细胞(hESCs)复苏 |
| 1.3.1.4 hESCs细胞传代 |
| 1.3.2 人肝癌干细胞分选 |
| 1.3.3 肝癌动物模型的建立 |
| 1.3.4 人肝癌干细胞体外培养 |
| 1.3.4.1 人肝癌干细胞MEF饲养层细胞上培养 |
| 1.3.4.2 人肝癌干细胞ECM培养板上培养 |
| 1.3.4.3 人肝癌干细胞冻存 |
| 1.3.5 移植瘤细胞制备、原代培养和冻存 |
| 1.3.6 流式细胞仪检测 |
| 1.3.7 细胞总RNA的提取 |
| 1.3.8 普通逆转录反应 |
| 1.3.9 荧光定量PCR |
| 1.3.9.1 Taqman荧光定量PCR反应体系 |
| 1.3.9.2 SYB荧光定量PCR反应体系 |
| 1.3.9.3 实时荧光定量PCR结果分析 |
| 1.3.10 细胞免疫荧光染色 |
| 1.3.11 瘤组织免疫组化染色 |
| 1.3.12 瘤组织免疫荧光染色 |
| 1.4 统计学分析 |
| 1.5 分选各细胞亚群实验流程 |
| 1.6 实验结果 |
| 1.6.1 CD34~+细胞的致瘤性 |
| 1.6.2 免疫荧光检测移植瘤分型 |
| 1.6.3 CD34+LCSCs培养和传代 |
| 1.6.4 CD34~+LCSCs生物学特征 |
| 1.6.5 CD34~+LCSCs体外分化检测 |
| 1.6.6 CD34~+LCSCs致瘤能力检测 |
| 1.7 讨论 |
| 1.8 结论 |
| 第二部分 CD34~+LCSCs来源探讨 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.4 主要实验仪器和设备 |
| 2.2 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.1.1 肝癌细胞等常规复苏和传代培养 |
| 2.3.1.2 饲养层细胞 |
| 2.3.2 人肝癌干细胞分选 |
| 2.3.3 肝癌动物模型的建立 |
| 2.3.4 人肝癌干细胞体外培养 |
| 2.3.4.1 人肝癌干细胞MEF饲养层细胞上培养 |
| 2.3.4.2 人肝癌干细胞ECM培养板上培养 |
| 2.3.4.3 人肝癌干细胞冻存 |
| 2.3.5 移植瘤细胞制备、原代培养和冻存 |
| 2.3.6 流式细胞仪检测 |
| 2.3.7 细胞总RNA的提取 |
| 2.3.8 普通逆转录反应 |
| 2.3.9 荧光定量PCR |
| 2.3.9.1 Taqman荧光定量PCR反应体系 |
| 2.3.9.2 SYB荧光定量PCR反应体系 |
| 2.3.9.3 实时荧光定量PCR结果分析 |
| 2.3.10 细胞免疫荧光染色 |
| 2.3.11 瘤组织免疫荧光染色 |
| 2.3.12 细胞吞噬实验 |
| 2.3.13 染色体分析(Karyotyping Assay) |
| 2.4 统计学分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 CD34~+LCSCs表达肝干细胞和骨髓单核细胞标记物 |
| 2.5.2 肝癌细胞和骨髓单核细胞标记物在人肝癌移植瘤中的表达 |
| 2.5.3 CD34+LCSCs及其移植瘤中CD45的表达 |
| 2.5.4 CD34~+LCSCs移植瘤细胞和PLC中细胞因子和趋化因子表达 |
| 2.5.5 CD34~+LCSCs移植瘤细胞和PLC的吞噬活性 |
| 2.5.6 CD34~+LCSCs移植细胞和PLC的人肝表型和功能 |
| 3.5.7 细胞遗传学分析 |
| 2.5.8 PLC的起源探讨 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 结论 |
| 结论及展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 英文缩写 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
| 论文相似性检测 |
（7）维吾尔族妇女宫颈癌细胞株的建立与生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 宫颈癌的概况和研究现状 |
| 2 原代培养技术 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 建立细胞株的组织来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要材料和仪器 |
| 1.4 主要液体的配制 |
| 1.5 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞生长曲线的绘制和形态学观察 |
| 2.3 细胞周期和染色体分析及集落形成的观察 |
| 2.4 细胞分子标志物检测 |
| 2.5 异种移植及病理学分析 |
| 2.6 细胞支原体污染检测及减血清培养 |
| 3 技术路线 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（8）来源于肝癌门静脉癌栓细胞系（CSQT-2）的建立及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 正文:来源于肝癌门静脉癌栓细胞系CSQT-2的生物学特性研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 细胞系相关文章 |
| 肝癌相关文章 |
| 文献综述 |
| 附件 |
| 致谢 |
（9）重组人生长激素干预GHR不同表达水平人肝癌细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 图及表清单 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一节 rhGH干预GHR不同表达状态人肝癌细胞增殖凋亡及效应因子分泌 |
| 1. 实验材料、设施和方法 |
| 2. 结果 |
| 第二节 rhGH干预GHR不同表达状态人肝癌细胞同环境共培养血管内皮细胞增殖 |
| 1. 实验材料、方法和设施 |
| 2. 结果 |
| 第三节 rhGH影响人肝癌细胞膜GHR受体密度变化 |
| 1. 实验材料、设施和方法 |
| 2. 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述1 |
| 参考文献 |
| 文献综述2 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 在读期间发表论文 |
| 附录Ⅱ 缩略词注释表 |
| 致谢 |
| 附录Ⅲ |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
（10）来源于肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系的建立及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 来源于肝癌门静脉癌栓的 人肝癌细胞系 CSQT-1 的建立 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 来源于门静脉癌栓的人肝癌细胞系 CSQT-1 的生物学特性鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 构建门静脉癌栓裸鼠模型及CSQT-2细胞系 的建立和特性分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
四、人肝癌细胞系HCC-9810的建立及染色体分析（论文参考文献）
- [1]中华鲟五种组织细胞系建立及青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定[D]. 王艺舟. 华中农业大学, 2020
- [2]稀有鮈鲫卵细胞系的建立及其对草鱼呼肠孤病毒增殖特性研究[D]. 刘世旭. 天津农学院, 2019(08)
- [3]超高灵敏流式检测技术在人类端粒长度的单染色体水平的应用[D]. 周颖星. 厦门大学, 2018(07)
- [4]多芯片联合解析ZCCHC13和PLCXD3基因在无精症、肝细胞癌中的表观遗传调控机理[D]. 李志明. 厦门大学, 2018(08)
- [5]树鼯肝细胞永生化方法的建立及ITH6.1细胞系特性分析[D]. 马娜. 北京协和医学院, 2016(01)
- [6]CD34+肝癌干细胞的分离、鉴定和来源探讨[D]. 张艳玲. 南方医科大学, 2015(05)
- [7]维吾尔族妇女宫颈癌细胞株的建立与生物学特性的研究[D]. 张璐. 新疆医科大学, 2012(02)
- [8]来源于肝癌门静脉癌栓细胞系（CSQT-2）的建立及其生物学特性研究[D]. 王涛. 第二军医大学, 2010(12)
- [9]重组人生长激素干预GHR不同表达水平人肝癌细胞的实验研究[D]. 李苏宜. 郑州大学, 2010(01)
- [10]来源于肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系的建立及其生物学特性研究[D]. 胡华生. 第二军医大学, 2009(10)