一、p53抑癌基因蛋白过表达在肉瘤发生中作用的研究（论文文献综述）
刘光平[1]（2021）在《TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究》文中研究指明【研究目的】骨肉瘤是一种起源于骨骼系统的恶性原发性肿瘤,其发病年龄多见于青少年和中青年人群,骨肉瘤发生的原因目前不明,主流的观点认为其主要与患者本身的基因缺陷、病毒感染及电离辐射等因素相关,最终导致骨骼系统产生不成熟的骨质或者类骨质成份。骨肉瘤恶性程度较高,容易发生远处转移（主要为肺部转移）,因此预后较差。尽管目前临床上施行手术、化疗、靶向治疗等综合治疗手段可以使骨肉瘤患者的生存率得到极大的提升,但国内骨肉瘤复发病人5年生存率仅20%左右,因此寻找有效治疗靶点、发现早期诊断标志物以及阐明其发病机制至关重要。TIPE基因家族由4个成员组成（包括TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3）,该基因家族与机体免疫调节和肿瘤发生密切相关。尽管四个成员之间具有显着的序列同源性,但它们参与了不同的细胞生物学活动调节过程。研究发现TIPE1在肝癌、乳腺癌等肿瘤类型中主要行使抑癌基因功能,课题组曾首次阐明TIPE1促进了宫颈癌及鼻咽癌的恶性生物学行为,但它在骨肉瘤中的生物学作用目前尚不清楚。本课题利用临床标本、细胞、动物模型及多种分子生物学技术,系统揭示TIPE1如何精准调控PRMT1活性,以及如何通过蛋白精氨酸甲基化修饰方式调控STAT3精氨酸位点甲基化水平参与骨肉瘤增殖的详细过程。本课题的完成不仅阐明了TIPE1在骨肉瘤发生中的新型分子机制,并可为骨肉瘤临床诊断及预后提供潜在的肿瘤分子标志物。【研究方法】一、TIPE1对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。1.细胞模型:为明确TIPE1对骨肉瘤细胞增殖水平是否有影响,我们在TIPE1表达较低的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5过表达TIPE1,在TIPE1表达较高的骨肉瘤细胞系MG63转染TIPE1干扰慢病毒,利用CCK8、克隆形成等实验观测细胞增殖指标,通过流式细胞仪PI染色技术检测细胞周期改变情况。2.裸鼠成瘤实验:选择4-6周龄BALB/c裸鼠,将过表达TIPE1的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5及对照细胞种植于裸鼠腋窝处皮下,进行裸鼠成瘤实验,待瘤体直径至0.5cm大小时,比较肿瘤生长速率、肿瘤体积变化。二、TIPE1通过调控PRMT1/STAT3通路调控骨肉瘤增殖的分子机制。1.TIPE1通过与PRMT1直接结合调控STAT3通路。（1）转录组芯片及基于IPA的经典通路分析:过表达TIPE1及对照的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5,经过准备poly-A RNA controls→合成第一链cDNA→合成第二链cDNA→通过体外转录合成标记cRNA→cRNA纯化及定量-→cRNA片段标记→杂交等步骤,得到芯片数据,最后通过基于IPA的经典通路分析,发现TIPE1在骨肉瘤中调控的关键通路STAT3;利用实时荧光定量PCR技术进行进一步验证。（2）利用Co-IP-MS等技术,初步确立TIPE1通过PRMT1调控下游分子STAT3的逻辑关系:首先构建用于Co-IP-MS技术的特殊TIPE1载体,在骨肉瘤细胞系中过表达,最后通过Co-IP→质谱分析→基于定量蛋白质组学的生信分析→Co-IP、Duolink等技术进一步验证,初步明确TIPE1通过与PRMT1直接结合,调控下游分子STAT3的确切分子机制。（3）干扰PRMT1,过表达TIPE1后Western Blot检测STAT3蛋白的表达变化,CCK8测生长曲线观测TIPE1对骨肉瘤增殖抑制现象的逆转,进一步明确TIPE1-PRMT1-STAT3的调控逻辑关系。2.PRMT1系列截短序列的构建及TIPE1与PRMT1相互作用位点的确定。根据PRMT1蛋白结构域,构建系列截短序列,在HEK293T细胞中共转染TIPE1-Flag和PRMT1-HA全长或不同缺失片段的表达载体,用Co-IP方法确定TIPE1蛋白与PRMT1相互作用的特定位点。3.TIPE1通过抑制PRMT1精氨酸甲基转移酶活性抑制STAT3甲基化水平。（1）利用精氨酸单甲基化修饰定量蛋白质组学技术,通过蛋白提取→蛋白酶解→MMA（精氨酸单甲基化）富集→质谱检测→信息分析等流程,鉴定TIPE1对骨肉瘤细胞系中精氨酸单甲基化修饰程度,以及STAT3蛋白精氨酸单甲基化修饰情况。（2）TIPE1抑制PRMT1对相关底物蛋白STAT3甲基化水平的验证:由于缺乏STAT3甲基化抗体,各组都首先转染STAT3-His,利用His抗体进行免疫共沉淀富集STAT3蛋白,最后利用通用型甲基化抗体检测STAT3甲基化水平。将TIPE1-Flag转染到HEK293T细胞中,检测在细胞正常生理条件下,TIPE1是否以剂量依赖方式调控内源PRMT1对其底物STAT3的甲基化能力。利用siRNA技术,将TIPE1-sh转染到HEK293T细胞中,抑制内源TIPE1的表达后,检测内源PRMT1对STAT3的甲基化水平影响;过表达TIPE1的HEK293T细胞中抑制内源PRMT1的表达后,检测PRMT1底物的甲基化水平。4.TIPE1抑制STAT3的转录水平。在HEK293T细胞中共转染pGL3-promoter vector 或者APRE luciferase reportorgene,以及PRMT1-HA、TIPE1-Flag、STAT3-His载体,在IL-6的刺激下,利用双荧光素酶活性测定发现TIPE1对PRMT1调控的下游基因STAT3的转录激活能力。三、临床标本验证TIPE1通过PRMT1/STAT3通路参与骨肉瘤发生。利用组织芯片,验证肿瘤组织中TIPE1表达水平与肿瘤分期的关系;分析TCGA数据库肿瘤组织中TIPE 1的表达与STAT3表达的相关性。【实验结果】一、TIPE1抑制骨肉瘤细胞增殖能力。1.体外实验。本研究结果显示TIPE1可明显抑制两种骨肉瘤细胞系的增殖速度,细胞周期结果提示TIPE1也显着降低骨肉瘤细胞周期S期比值,另外TIPE1可使骨肉瘤细胞克隆形成能力明显减弱。2.体内实验。本研究结果提示TIPE1可显着抑制骨肉瘤细胞裸鼠成瘤能力,进一步的免疫组化结果表明TIPE1可抑制细胞增殖指标Ki67的表达水平。二、TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖的分子机制。1.TIPE1通过与PRMT1直接结合调控STAT3通路。前期结果提示TIPE1可以抑制骨肉瘤细胞增殖,为进一步明确其中机制,课题组利用转录组芯片及基于IPA的经典通路分析,结果提示TIPE1在骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5中主要抑制STAT3通路,qPCR验证结果也显示过表达TIPE1后STAT3表达明显降低。那么,TIPE1在骨肉瘤中抑制STAT3通路的机制到底如何?带着上述疑问,课题组利用Co-IP-MS等技术,发现TIPE1可能通过与PRMT1相互作用发挥生物学功能。基于STAT3蛋白是PRMT1的已知调控底物,因此我们认为TIPE1通过抑制PRMT1的功能,继而影响了 STAT3的表达。继而,我们利用挽救实验对PRMT1进行干扰后,发现可逆转过表达TIPE1导致的STAT3抑制现象,且骨肉瘤细胞增殖被TIPE1抑制的现象也明显得以逆转。以上结果表明TIPE1可能通过PRMT1抑制了 STAT3通路。2.PRMT1系列截短序列的构建及TIPE1与PRMT1相互作用位点的确定。课题组构建了系列截短PRMT1序列,通过Co-IP实验发现TIPE1蛋白主要与PRMT1的催化区域结合。3.TIPE1通过抑制PRMT1精氨酸甲基转移酶活性抑制STAT3甲基化水平。TIPE1究竟通过哪种方式来抑制PRMT1的甲基转移能力是课题组的主要研究内容之一,已有研究发现PRMT1甲基化酶催化区和同源二聚化区是其发挥甲基化酶活性最关键的结构域。基于上述结果发现TIPE1主要与PRMT1催化区域结合,我们认为TIPE1可能影响了 PRMT1的甲基化酶活性。因此,利用精氨酸单甲基化修饰定量蛋白质组学技术发现TIPE1可下调STAT3精氨酸位点甲基化水平。进一步分析发现过表达TIPE1以浓度依赖方式抑制内源PRMT1介导的STAT3甲基化,干扰TIPE1则促进内源PRMT1介导的STAT3甲基化。4.TIPE1抑制STAT3的转录水平。利用双荧光素酶活性实验发现TIPE1抑制PRMT1调控的下游基因STAT3的转录能力。我们的结果发现TIPE1可显着抑制PRMT1介导的STAT3转录水平,该结果进一步提示TIPE1通过抑制PRMT1底物STAT3甲基化水平,将最终导致STAT3转录水平的下调。三、临床标本验证TIPE1抑制STAT3通路参与骨肉瘤发生。利用组织芯片,发现肿瘤组织中TIPE1表达水平与骨肉瘤肿瘤分期负相关,TCGA数据库显示肉瘤组织中TIPE1的表达与STAT3表达也具有负相关性。该结果在临床上进一步证实了 TIPE1负调控STAT3的现象。【结论】虽然文献报道了 PRMT1及STAT3在肿瘤中的重要生物学功能,并初步阐述了PRMT1调控STAT3的相关机制,但是TIPE1如何调控PRMT1及相关下游信号通路尚不明确。本课题的完成阐明了TIPE1精准调控PRMT1活性的方式,明确了TIPE1通过调控PRMT1活性,继而影响下游分子STAT3表达的确切分子机制,最终对骨肉瘤细胞增殖起明显抑制作用。本课题的完成将为骨肉瘤患者的临床诊疗提供了新的靶点和治疗策略,同时为骨肉瘤预后预测及早期诊断标志物的发现提供理论与实践可能。
胡代星[2]（2021）在《NPRL2基因转录水平调控及促进前列腺癌细胞增殖的机制研究》文中提出第一部分NPRL2基因在前列腺癌组织中的生物信息学分析目的:运用公共数据库对NPRL2基因进行大数据的生物信息学分析。方法:主要参考TCGA和部分GEO数据库中的全转录组数据及临床信息,分析大数据中NPRL2在前列腺癌中的特征,并以TCGA数据库中的样本进行GSEA富集分析。结果:在TCGA数据库中,NPRL2在前列腺癌组织中的表达量不同于以往为抑癌基因的特点,其显着高表达。同时,我们运用两个GEO数据集（GSE68882和GSE6956）也发现了相似的结果。TCGA及GEO数据库是检测NPRL2的m RNA表达水平,进一步我们通过公共数据库中的免疫组化法检测结果发现了与TCGA等数据库中的相似结论,即蛋白水平也存在高表达。随后,将TCGA中485例有完整预后信息的前列腺癌患者进行了分析,以NPRL2的中位表达值分界,发现NPRL2高表达的患者预后更差。最后,我们运用TCGA的转录组数据,以NPRL2的高、低表达进行GSEA富集分析,发现NPRL2在前列腺癌中可能参与多种功能,如:阿尔兹海默症、帕金森病、小细胞肺癌、缝隙连接、肿瘤通路、WNT通路、ERBB通路、HEDGEHOG通路、脂肪酸代谢、肾上皮发育、腺体发生和线粒体蛋白复合物等。结论:NPRL2在前列腺癌中的特点不同于既往对该基因的研究,结果甚至完全相反,表现为一个癌基因。且该基因可能参与了前列腺癌发生、发展中的多种生物学行为。第二部分NPRL2基因转录水平调控的分子机制目的:探究NPRL2基因的转录水平调控机制,寻找正向调控其表达的转录因子,揭示NPRL2基因在前列腺癌中高表达的机制。方法:通过普通PCR、报告基因及转录因子预测软件等对NPRL2的上游序列进行分析,通过Western blot、q PCR、双萤光素霉报告基因和染色质免疫共沉淀（Ch IP）检测转录因子与NPRL2的结合情况。结果:首先我们通过NCBI获取NPRL2转录起始上游-2000bp的序列,通过普通PCR构建NPRL2上游-2000bp启动子序列,并以-2000bp序列为基础构建不同长度的启动子序列。通过质粒装载,转染细胞后检测双萤光素霉报告基因的活性,发现-1500至-1100bp的启动子活性最强,并通过JASPAR预测了多个转录因子结合的位点,设计si RNA验证,发现沉默转录因子c-Jun时,NPRL2的m RNA及蛋白表达水平显着被抑制。随后双萤光素霉报告基因及Ch IP证实c-Jun能与NPRL2的上游序列所结合,从而调控NPRL2的表达。分析GSE6956数据集发现c-Jun在前列腺癌中的表达显着高于正常组织。GSE68882数据集中NPRL2表达与c-Jun呈显着正相关,依据NPRL2和c-Jun的中位值在TCGA数据库中探讨了基因表达与前列腺癌患者预后的情况,发现NPRL2和c-Jun同时高表达的患者的无病生存和总生存均最差。结论:转录因子c-Jun能在转录水平与NPRL2的上游启动子结合,从而促进NPRL2的表达。第三部分NPRL2基因对前列腺癌细胞增殖功能的作用及机制目的:研究NPRL2基因的沉默或过表达及上游调控分子c-Jun的沉默或过表达对前列腺癌细胞增殖功能的影响。方法:采用分子生物学中常规检测细胞增殖、凋亡的实验验证NPRL2基因对前列腺癌细胞增殖活性的影响。同时,在沉默或过表达NPRL2的前提下增加沉默或过表达c-Jun,探讨c-Jun与NPRL2在功能上的相关性。结果:CCK-8法发现NPRL2能够促进前列腺癌细胞的生长能力,克隆形成实验也发现了相似的结论。在细胞的凋亡维度,NPRL2发挥抗前列腺癌凋亡的作用,裸鼠成瘤实验发现沉默NPRL2的前列腺癌细胞系相比空白组细胞,瘤体更小且重量更轻。随后,在过表达和沉默NPRL2的基础上,增加了沉默及过表达c-Jun的组别,发现在前列腺癌细胞系PC3及LNCa P的细胞中,同时过表达c-Jun及NPRL2时,相较过表达NPRL2的同时沉默c-Jun组,细胞的生长显着加快,存活能力增强,细胞凋亡率降低,凋亡蛋白Caspase 3（cleaved）、BAX的表达均降低。而同时沉默c-Jun及NPRL2时,细胞的增殖活性明显减弱,凋亡率显着增加,凋亡蛋白Caspase 3（cleaved）、BAX的表达均显着升高。结论:NPRL2基因在前列腺癌中发挥促增殖的作用,且该作用与c-Jun的参与有关,c-Jun能够增强NPRL2的这种促增殖作用。第四部分NPRL2促进前列腺癌增殖的分子机制探讨目的:探讨NPRL2通过何种机制在前列腺癌中发挥促增殖作用,为今后针对以NPRL2为靶点的治疗提供依据。方法:通过转录组测序的方法分析沉默NPRL2的PC3细胞与空白组细胞的差异基因表达,并对差异基因进行KEGG通路分析,进而通过Western blot检测通路分子在沉默或过表达NPRL2后的差异,在此基础上加入通路抑制剂再次验证通路分子的表达变化。结果:首先我们通过转录组测序比较了沉默NPRL2与否的PC3的差异基因,发现它们富集最多的通路为PI3K/AKT,而该通路参与了多种肿瘤的促增殖作用,Western blot结果显示,在前列腺癌细胞PC3及LNCa P中,沉默NPRL2时PI3K/AKT通路上的关键分子,p-AKT、p-MDM2均显着降低,而过表达NPRL2时,p-AKT、p-MDM2的表达显着升高,因为PC3细胞为p53天然阴性的细胞系,因此沉默和过表达NPRL2对PC3细胞中p53的表达无明显影响,而在LNCa P细胞系中,沉默和过表达NPRL2分别上调和下调p53的表达。随后,我们在过表达NPRL2组的前列腺癌细胞中加入了AKT的抑制剂MK2206,结果显示,加入MK2206后,即使过表达NPRL2,p-AKT、p-MDM2的表达均显着降低。同时,CCK-8实验提示加入MK2206的前列腺癌细胞细胞,即使过表达NPRL2,较空白组细胞的增殖活性显着降低。相较空白组,过表达NPRL2组的凋亡蛋白Caspase 3（cleaved）和BAX显着降低,而过表达NPRL2的同时加入MK2206组的凋亡蛋白Caspase3（cleaved）和BAX表达则显着升高,BCL2的表达与Caspase 3（cleaved）和BAX的表达变化相反。同时,NPRL2可能对CDK2存在调控作用,从而影响了AKT通路,而CDK2可能作为一个中间效应分子介导了NPRL2对AKT/MDM2/p53通路的作用。结论:NPRL2通过调控AKT/MDM2/p53通路进而促进前列腺癌细胞增殖。第五部分前列腺癌自噬相关基因预后模型的构建与分析目的:自噬相关基因可能在前列腺癌中参与了多种生物学功能,然而目前关于自噬相关基因的大数据生物信息学分析较少。通过分析自噬相关基因在前列腺癌中的表达差异及功能特点,构建自噬相关基因的预后模型,指导对患者预后的评估。方法:首先,从人类自噬数据库获得了共234个自噬相关基因（ARG）的信息。然后,根据癌症基因组图谱（TCGA）数据库,在前列腺癌患者中鉴定出差异表达的ARG。进行单因素和多因素Cox回归分析以筛选核心预后ARG与前列腺癌患者总生存期（OS）和无病生存期（DFS）的关系,并建立了预后模型。最后,进一步分析了预后模型与临床病理参数之间的相关性,包括年龄,T分期,N分期和Gleason评分等。结果:通过单因素和多因素Cox回归分析,总生存相关的预后模型是基于五个ARG（FAM215A,FDD,MYC,RHEB和ATG16L1）所构建的,并将前列腺癌患者按模型分为高风险和低风险组（HR=6.391,95%CI=1.581–25.840,P<0.001）。预测模型的受试者工作特性曲线下面积（AUC）为0.84。T3-4期和Gleason评分>7的前列腺癌患者OS相关的预测模型评分显着高于T1-2期患者（P=0.008）,和Gleason评分≤7的患者（P=0.015）。此外,基于22种ARG（ULK2,NLRC4,MAPK1,ATG4D,MAPK3,ATG2A,ATG9B,FOXO1,PTEN,HDAC6,PRKN,HSPB8,P4HB,MAP2K7,MTOR,RHEB,TSC1,BIRC5,RGS19,RAB24,PTK6和NRG2）构建了DFS相关的预后模型,AUC为0.85（HR=7.407,95%CI=4.850-11.320,P<0.001）,DFS相关的预后模型与前列腺癌患者T分期（P<0.001）,N分期及Gleason评分（P<0.001）密切相关（P=0.001）。NPRL2基因与这些预后相关的自噬基因大多存在相关性,如MAPK1、FOX01、PRKN、HSPB8、ULK2、TSC1、MTOR等,可见NPRL2可能参与到了自噬的多个环节。结论:本部分研究成功构建了前列腺癌中自噬相关基因的两套预测模型,分别预测患者的总生存和无病生存,针对这些预后相关核心的进一步研究可能为前列腺癌的诊断及治疗提供新的思路和依据。
陈鹏[3]（2021）在《陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究》文中研究表明目的:通过非编码RNA基因多态性筛选出陕西汉族结直肠癌易感人群,筛选与结直肠癌发生密切相关microRNA,并对其在结直肠癌发生发展中的作用进行探讨,为临床预防及早期诊断结直肠癌提供理论依据。方法:1.设计一项包括514例CRC患者和510例健康对照的病例-对照关联研究,选取9个lnc RNAs基因[MIR137HG、MIR143HG（CARMN）、MIR3142HG、LINC-PINT、MIR124-1HG、MIR675HG（H19）、MIR17HG、MIR497HG和MIR133A1HG]、7个miRNAs基因（MIR577、MIR608、MIR675、MIR192、MIR618、MIR492和MIR423）及GREM1基因的49个SNPs,采用Agena Mass ARRAY基因分型技术,对所筛选的SNPs位点进行基因分型,通过卡方检验、logistic回归分析在遗传模型和分层分析下这些位点与中国陕西汉族人群CRC发病风险及临床病理参数之间的关系。并进行单倍型分析及MDR分析寻找预测CRC风险的最佳模型。2.分析MIR17HG及miR-17-92a簇在CRC病例及对照组的组织及血液中的表达。从TCGA和GDC数据库下载肿瘤RNA-seq数据,分析MIR17HG的mRNA表达。在TCGA数据库中下载生存数据用于生存分析,下载miRNA-seq表达量数据用于分析不同疾病分期的差异。从SRA和GEO数据库中下载数据用于健康人和患者血清及不同临床分期患者血清中游离miR-17-92a簇的丰度比较。3.纳入未经过任何治疗的陕西汉族病例50例,健康对照50例,用RT-qPCR对其血清中miR-17-92a簇的microRNAs表达进行检测,用ROC曲线判断这些microRNAs在诊断结直肠癌病例中的作用。4.用hsa-miR-18a-5p mimics和hsa-miR-18a-5p inhibitor对结直肠癌HCT116和SW480进行处理,研究hsa-miR-18a-5p对结直肠癌细胞的作用。利用shortest path算法分析蛋白互作网络中各基因与表达差异基因之间的网络关系,筛选结直肠癌的候选关键靶基因并进行初步验证。结果:1.rs73376930与增加中国陕西汉族CRC发病风险相关;而rs7549905、rs7318578、rs633727和rs58658771与降低中国陕西汉族CRC发病风险相关。单倍型GA较CA（rs3024270和rs2075744）、单倍型CT较TA（rs4779584和rs58658771）、单倍型AA较AG（rs2293581和rs73376930）均与降低CRC风险相关。含5个SNPs位点的模型（rs9440302,rs353300,rs1582417,rs157928,rs3024270）为预测CRC最佳模型,其交叉检验一致性为9/10,平衡精确性为:0.719,可预测患CRC的风险OR为6.65（95%CI:4.96-8.91）。2.MIR17HG在CRC组织中高表达,在Ⅳ期病例及黑种人中最高。miR-17-92a簇在CRC组织及血清中高表达,hsa-miR-20a-5p表达量最高。3.在陕西汉族结直肠癌病例血清中hsa-miR-18a-5p和has-miR-92a-1相对表达量高于正常人群。hsa-miR-18a-5p表达量与临床分期相关。血清hsa-miR-18a-5p+CEA+AFP诊断早期结直肠癌的AUC=0.899（95%CI:0.836-0.962,P<0.001）,灵敏度=0.88,特异性=0.738,优于单一指标。4.hsa-miR-18a-5p能降低CRC细胞的增殖、克隆形成能力,增加细胞凋亡的发生。用最短距离算法评估hsa-miR-18a-5p可能的11个靶基因,hsa-miR-18a-5p可能通过靶向LIF起到抑制CRC发展的作用。结论:1.非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关。含五个SNPs的模型可以预测CRC的发病风险。2.MIR17HG与结直肠癌发生密切相关。MIR17HG及其microRNAs在CRC组织中高表达,表达量与临床分期及种族相关。miR-17-92a簇在CRC血清中高表达。3.在陕西汉族CRC血清中hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-92a-3p表达量增加,hsa-miR-18a-5p+CEA+AFP在诊断早期结直肠癌中具有优越性。4.hsa-miR-18a-5p的高表达能降低结直肠癌细胞的增殖、克隆形成能力,促进细胞凋亡的发生。
杨香琳[4]（2021）在《microRNA-143和CBFB基因多态性与肺癌易感性的关系及机制研究》文中指出目的:众所周知,肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康和生活质量。在我国,肺癌的发生率和死亡率呈现逐渐上升的趋势。与此同时,我国的肺癌的癌症负担也是比较重的,大约占全球总病例数的36.98%和总死亡数的39.21%。早期肺癌的隐匿症状,导致多数患者被诊断为肺癌时,手术机会的丧失,因此,单纯化疗或联合放疗已成为晚期肺癌患者的主要治疗方法。尽管现代医疗技术在肺癌的诊断和治疗方面取得了进步,但是肺癌患者的5年生存率一直不尽人意。多项研究表明,肺癌的发生发展与多种基因的异常表达密切相关,如癌基因、抑癌基因等。因此,深入探索肺癌进展的分子机制有助于开发新的肺癌防治靶点。microRNAs（miRNAs）是一类内源性的（18-24个核苷酸）非编码单链RNA,在代谢、生长、细胞分化和发育、凋亡和细胞信号转导等不同的生物学过程中都发挥着重要作用。mi RNA通过将其种子区（第2-8位）与位于靶标3’UTR区域以及编码区中的互补序列进行配对,识别m RNA靶标并且通过m RNA的降解和翻译抑制来充当基因表达的内源性抑制剂。同时,它们也在基因表达的转录后调控中发挥着重要作用。有大量的研究证明,无论是影响mi RNA发生过程中的primi RNA、pre-mi RNA和成熟mi RNA中发生的单核苷酸基因多态性（SNPs）,还是影响mi RNA识别其m RNA靶序列的能力或影响mi RNA靶向双链形成的单核苷酸基因多态性,都可能通过修饰mi RNA调节来影响人类表型的变异和疾病易感性的改变。之前的一些研究结果表明,mi R-143在多种人类癌症中主要扮演抑癌基因的角色。本研究通过探索mi R-143启动子区单核苷酸多态性与肺癌发病风险之间的关系,mi R-143靶基因CBFB基因多态性与肺癌发病风险之间的联系,mi R-143和CBFB在TCGA肺腺癌组织中的表达及与肺腺癌预后的相关性,以及mi R-143对肺癌细胞生物行为的影响四个方面对mi R-143及CBFB在肺癌中发生发展的机制进行初步的探索。研究方法:第一部分:首先我们通过浏览文献和筛选NCBI的db SNP数据库的结果,同时综合SNP功能预测网站,我们选出待研究的mi R-143/mi R-145启动子区rs3733845和rs3733846位点进行下一步的研究。本研究是一项基于医院的病例对照研究,旨在探讨mi R-143/145启动子区rs3733845和rs3733846多态性与肺癌发病风险的关系。本研究的病例来自于三所医院,它们分别是中国医科大学附属第一医院,中国医科大学第四附属医院和辽宁省肿瘤医院。所有的研究对象都签署了知情同意书,本研究经过中国医科大学伦理委员会的审批。我们用Taq Man探针法对575例非吸烟患者和575例无癌对照者mi R-143/145启动子区的两个SNPs进行了基因分型。运用Logistic回归分析评估mi R-143/mi R-145启动子多态性与女性肺癌发病风险之间的关系。采用交叉分析的方法探讨了两个SNPs与环境危险因素（烹调油烟暴露和被动吸烟暴露）之间的相互作用。第二部分:我们对非吸烟女性中CBFB基因的rs12598154和rs17768165多态性与肺癌风险之间的联系进行了探索。本部分是一项基于医院的病例对照研究,本研究对象包括556例肺癌患者和395例对照,并且所有的研究对象都签署了知情同意书。本研究的病例来自于中国医科大学附属第一医院,中国医科大学第四附属医院和辽宁省肿瘤医院。本研究得到了中国医科大学伦理委员会的批准。由受过专业培训的访问员来收集人口统计学数据和环境暴露（烹调油烟和被动吸烟暴露）的相关信息。使用Taq Man探针法对所有研究对象的基因组DNA进行基因分型。运用Logistic回归分析来对CBFB基因的rs12598154和rs17768165多态性与非吸烟女性肺癌风险之间的关系进行评估。采用交叉分析的方法探讨了两个SNPs与环境危险因素（烹调油烟暴露和被动吸烟暴露）之间的相互作用。第三部分:首先通过TCGA数据库中下载和分析肺腺癌相关数据,并利用R软件分析探索mi R-143-3p在肺腺癌中的表达情况、预后以及可能参与的生物学通路。利用生物学信息网站（Targetscan、mi RWalk、mi RDB、mi RDIP）,预测出mi R-143-3p的靶基因可能是CBFB。其次,在TCGA数据库中下载和分析肺腺癌的相关数据,并利用R软件分析探索CBFB在肺腺癌组织中的表达情况、与肺腺癌预后的相关性以及可能参与的生物学通路。第四部分:首先通过qRT-PCR检测mi R-143-3p在肺腺癌细胞系A549、H1299和人正常肺上皮细胞系BEAS-2B中的表达,向A549和H1299细胞系中转染mi R-143-3p mimics、inhibitor及NC质粒改变mi R-143-3p表达,通过MTS实验检测肺腺癌细胞增殖能力的改变;通过Transwell实验检测肺腺癌细胞迁移能力的改变;通过Annexin 7-AAD/APC检测肺腺癌细胞凋亡能力的改变。通过双荧光素酶实验及回复实验验证mi R-143-3p通过抑制CBFB表达对细胞增殖、迁移和凋亡的影响。本研究构建CBFB过表达质粒、低表达质粒及阴性对照质粒,进而改变A549和H1299细胞中CBFB表达,通过MTS实验检测肺腺癌细胞增殖能力的改变;通过Transwell实验检测肺腺癌细胞迁移能力的改变;通过Annexin7-AAD/APC检测肺腺癌细胞凋亡能力的改变。结果:第一部分:rs3733845和rs3733846与肺癌风险之间的关系不具有统计学意义。但是在分层分析中,rs3733845 T等位基因增加了肺腺癌的风险。携带rs3733846的AG基因型的受试者与AA基因型相比显示出了更高的肺腺癌风险。此外,与AA基因型相比,在显性模型中与rs3733846的G等位基因携带者相关的肺腺癌风险显着增高。rs3733845和rs3733846与肺鳞癌和小细胞肺癌中之间不具有统计学意义的关联。rs3733845和rs3733846危险基因型与烹调油烟暴露之间的存在相乘的相互作用,具有统计学意义。rs3733845和rs3733846位点与被动吸烟暴露的交互作用与肺癌易感性的关联不具有统计学意义。第二部分:CBFB的rs12598154和rs17768165位点与肺癌的发病风险不具有统计学意义的关联。分层分析结果显示,在非吸烟女性人群中,CBFB的rs12598154和rs17768165位点与肺腺癌,肺鳞癌和肺小细胞癌的易感性均不具有统计学意义的关联。在非吸烟女性人群中,CBFB的rs12598154和rs17768165位点与烹调油烟暴露的交互作用与肺癌易感性的关联不存在统计学意义。CBFB的rs12598154和rs17768165位点与被动吸烟暴露的交互作用与肺癌易感性的关联不存在统计学上的意义。第三部分:TCGA数据库中肺腺癌数据集mi R-143-3p呈低表达,且具有良好的诊断效能。生物信息学预测mi R-143-3p可能参与p53信号通路。应用Targetscan等生物信息学网站预测CBFB可能为mi R-143-3p下游靶基因,且TCGA数据库肺腺癌数据集中CBFB与mi R-143-3p表达负相关。TCGA数据库中肺腺癌数据集CBFB呈高表达,诊断效能良好,且CBFB差异表达与肺腺癌患者预后显着相关。GSEA结果预测CBFB可能参与p53信号通路。第四部分:qRT-PCR结果显示,mi R-143-3p在肺腺癌细胞中呈低表达,细胞功能学实验结果显示与对照组相比,mi R-143-3p低表达可显着促进肺腺癌细胞增殖、迁移,同时显着抑制肺腺癌细胞凋亡;相反,mi R-143-3p表达上调可显着抑制肺腺癌细胞增殖、迁移,同时肺腺癌细胞凋亡能力显着增强。qRT-PCR结果显示在p53过表达组中的mi R-143-3p表达显着上调。qRT-PCR及Western Blot实验结果显示mi R-143-3p可显着抑制CBFB表达。细胞功能学回复实验结果显示,mi R-143-3p可通过显着抑制CBFB表达调控肺腺癌细胞增殖、迁移和凋亡。qRT-PCR结果显示CBFB在肺腺癌细胞中呈高表达,细胞功能学实验结果显示,与阴性对照组相比,CBFB高表达可显着促进肺腺癌细胞增殖、迁移,同时显着抑制肺腺癌细胞凋亡;相反,CBFB低表达可显着抑制肺腺癌细胞增殖、迁移,同时肺腺癌细胞凋亡能力显着增强。Western Blot结果显示在CBFB过表达组的细胞中p53蛋白表达显着上升,相反CBFB低表达组的细胞中p53蛋白表达显着下降。结论:1.在非吸烟女性中,rs3733845与rs3733846与肺腺癌易感性相关,与肺鳞癌和小细胞肺癌之间不具有统计学意义的关联。rs3733845和rs3733846危险基因型与烹调油烟暴露之间存在相乘交互作用。2.CBFB的rs12598154和rs17768165位点与肺癌的发病风险不具有统计学意义的关联。3.TCGA数据库中mi R-143-3p在肺腺癌中呈低表达,CBFB在肺腺癌组织中呈高表达,均具有良好的诊断效能,生物信息学预测mi R-143-3p和CBFB可能与p53信号通路相关。4.mi R-143-3p可以通过抑制CBFB基因表达抑制肺腺癌细胞增殖及迁移,同时促进癌细胞凋亡。
谷佳[5]（2021）在《miR-552通过靶向p53调控喉癌细胞生长、转移和干性的研究》文中进行了进一步梳理目的:喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,在我国东北部地区高发,且发病率呈逐年上升趋势,已成为危害人民身体健康的重要疾病之一。目前喉癌的治疗是以手术为主辅以放疗和化疗的综合治疗。近年来尽管喉癌在治疗上取得了多方面的进展,但由于缺乏有效的早期诊断标志物,易发生恶性增殖与颈部淋巴结转移,加之缺少特异敏感的药物,喉癌患者的喉功能保存率及五年生存率难以获得实质性的提高。因此,研究喉癌的发病机制,寻找新的治疗靶点,提高喉癌患者的临床疗效,已成为当务之急。MicroRNAs（miRNAs）属于非编码RNA,是由约22个核苷酸构成的小分子RNA。Mi RNAs通过靶向靶分子的3’端非翻译区（untranslated region,UTR）发挥转录后调控的作用。越来越多的研究结果显示miRNAs参与肿瘤的各个过程,包括肿瘤发生、增殖、转移、复发和耐药等。例如,miR-365可通过RAC1途径调控肝癌干细胞。Mi R-383-5p通过靶向HDAC9分子进而抑制胃癌的进展。有研究报道miRNAs存在于各种体液中,结构稳定且可反映起源组织的病理生理状况,这一特点可使它成为新的有前途的生物标志物。多项研究报道了数种在人类喉癌中异常表达的不同miRNAs,包括miR-9、miR-29a-3p、miRNA-221等。miR-552是一种新发现的miRNA,其在生理或病理过程中发挥的作用及作用机制尚未被完全阐明。既往研究表明,miR-552可通过靶向WIF1促进骨肉瘤细胞的增殖和转移。此外,Mi R-552通过抑制AJAP1表达促进肝癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转换（epithelial mesenchymal transition,EMT）。同时还有研究报道miR-552促进肝癌起始细胞的自我更新及化疗耐药。然而,作为重要的节点分子miR-552在喉癌中的生物学作用及调控机制尚不清楚。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）是一小群具有自我更新能力和致瘤性的癌细胞,已有研究表明肿瘤干细胞是肿瘤形成、生长、转移、复发和介导放疗抵抗和化疗耐药的最主要原因。越来越多的证据表明喉癌中存在肿瘤干细胞,可利用其干性标志蛋白CD133、CD44直接从切除的喉癌组织中分离出来。此外,也可以从原代培养的人喉癌细胞中鉴定出肿瘤干样细胞。因此,研究喉癌干细胞特性有助于阐明喉癌的发展,对于深入了解喉癌的复发转移也具有重要意义。本课题拟检测喉癌组织及细胞中miR-552的表达情况,通过设计包装miR-552的过表达和敲减慢病毒,感染喉癌细胞系建立稳定的过表达和敲减细胞系,通过体内和体外实验研究miR-552对喉癌细胞生长和转移的调控作用;通过流式细胞仪和低粘附培养富集喉癌干细胞,检测分析miR-552在喉癌干细胞中的表达情况,并利用稳定的miR-552敲减细胞系研究其对喉癌干细胞自我更新和体内成瘤能力的影响;通过生物信息学分析找到miR-552可能的下游信号分子p53,并利用经典的生物学方法验证miR-552通过p53调控喉癌细胞的生长、转移和自我更新;希望通过本项研究,能为喉癌增殖、转移及干性的调控提供新的分子机制,为喉癌诊断、治疗和预后判定分子标志物的深入研究奠定理论基础。研究方法:本研究纳入56例2019年1月-2019年6月在中国医科大学附属第一医院住院明确诊断为喉鳞状细胞癌的患者。其手术切除的喉癌组织和癌旁对照组织立即在液氮中快速冷冻,并在-80°C条件下保存,供后续分析。每位患者均已签署了知情同意书,且研究方案经中国医科大学附属第一医院医学科学研究伦理委员会批准;于中国科学院细胞库（上海）购买了M2E,M4E,TU212和Hep-2的喉癌细胞系;于中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司购买6周龄雄性裸鼠及6周龄雄性NOD-SCID小鼠,按照SPF级实验动物饲养标准饲养。购买回来之后在动物房饲养一周以上后方进行实验,动物实验通过中国医科大学实验动物福利与伦理审查会批准。1.收集喉癌临床组织标本,利用Real-time PCR检测miR-552的表达情况,并用统计学方法分析miR-552的表达与临床病理及其他数据的相关性;2.设计构建miR-552过表达及敲减的质粒,包装慢病毒,感染喉癌M4E及Hep-2细胞系建立miR-552特异性过表达及敲减的稳定转染细胞系及其对照细胞系;3.利用miR-552 sponge和miR-552 mimic细胞及其对照细胞,采用CCK8、平板克隆形成、流式细胞周期、EDU免疫荧光等实验方法观察miR-552受干扰后对喉癌细胞体外增殖能力的影响;4.利用Hep-2的miR-552 sponge细胞及其对照细胞进行裸鼠皮下荷瘤实验,并利用免疫组织化学实验检测荷瘤组织中Ki67的表达,观察miR-552对喉癌细胞体内增殖能力的调控;5.利用miR-552 sponge和miR-552 mimic细胞及其对照细胞,采用transwell、invasion实验观察miR-552对喉癌细胞体外迁移及转移能力的调控;6.利用Hep-2的miR-552 sponge细胞及其对照细胞进行裸鼠尾静脉注射建立裸鼠体内肺转移模型实验,检测miR-552对喉癌细胞体内转移能力的调控;7.通过流式细胞仪分选或低粘附培养富集喉癌干细胞,利用Real-time PCR检测miR-552在喉癌干细胞中的表达情况;8.利用miR-552 sponge细胞及其对照细胞进行Real-time PCR实验,检测敲减miR-552后喉癌干细胞表面标志物及相关转录因子的变化;9.利用miR-552 sponge细胞及其对照细胞,进行低粘附成球培养和体外有限稀释实验,检测miR-552对喉癌干细胞自我更新能力及干细胞比例的调控;10.利用M4E的miR-552 sponge细胞及其对照细胞,进行体内有限稀释实验检测miR-552对喉癌干细胞体内成瘤能力的调控;11.通过生物信息学分析预测miR-552的下游分子,并利用经典的生物学技术Real-time PCR、western blot、荧光素酶报告基因和免疫组织化学实验在喉癌细胞、喉癌组织及裸鼠荷瘤组织中进一步验证;12.通过特异性的si RNA沉默miR-552 sponge及对照喉癌细胞中p53的表达,然后进行CCK8、平板克隆形成、transwell、invasion、低粘附成球培养和体外有限稀释等实验,验证miR-552通过p53调控喉癌细胞的进展;13.通过特异性的慢病毒过表达miR-552 sponge及对照喉癌细胞中p53的表达,然后进行CCK8、平板克隆形成、transwell、invasion、低粘附成球培养和体外有限稀释等实验,进一步验证miR-552通过p53调控喉癌细胞的进展。结果:通过一系列体内体外实验我们发现:1.Real-time PCR证实miR-552在喉癌组织中的表达水平显着高于癌旁组织;晚期喉癌组织中其表达水平高于早期喉癌;四种喉癌细胞系中miR-552表达水平均较正常黏膜细胞高;运用统计学方法分析发现miR-552高表达水平的患者更倾向于有低级别的病理分级;2.通过CCK8、平板克隆形成、流式细胞周期、EDU免疫荧光、裸鼠皮下荷瘤、免疫组织化学等实验方法发现,敲减miR-552抑制喉癌细胞的生长,过表达miR-552促进喉癌细胞的生长;3.通过transwell、invasion、裸鼠肺转移等实验发现,敲减miR-552抑制喉癌细胞的迁移及侵袭能力,过表达miR-552促进喉癌细胞的迁移及侵袭能力;4.通过Real-time PCR检测发现miR-552在喉癌干细胞中表达升高;5.通过Real-time PCR、低黏附成球、体外有限稀释及体内有限稀释实验发现,敲减miR-552的表达可下调喉癌干细胞表面标志物CD133,CD44和相关转录因子SOX2,OCT4的表达,抑制喉癌干细胞的自我更新能力,降低喉癌干细胞的比例,抑制喉癌干细胞的动物体内成瘤能力;6.生物信息学分析发现p53是miR-552的下游分子,通过Real-time PCR、western blot和荧光素酶报告基因实验进一步明确miR-552通过靶向p53的3’-UTR调控其表达;对喉癌临床样本及裸鼠荷瘤组织分析发现miR-552与p53的表达呈负相关;7.沉默或过表达p53可以减弱miR-552敲减喉癌细胞及其对照细胞生长、迁移、侵袭及自我更新能力的差异,进一步明确miR-552通过下调p53来调控喉癌细胞的生长、迁移、侵袭及自我更新。结论:根据本研究可得出以下结论:喉癌组织及喉癌细胞中miR-552的表达水平呈升高趋势,肿瘤分期越晚或病理分级越低,患者喉癌组织中miR-552的表达水平越高;在喉癌中,p53可能是miR-552的直接调控靶点;miR-552能够通过下调p53促进喉癌细胞的生长、迁移和侵袭,促进喉癌干细胞的自我更新。我们的结果为喉癌生长、转移及干性的调控提供新的分子机制,为喉癌诊断、治疗和预后判定分子标志物的深入研究奠定理论基础。
范人杰[6]（2020）在《MiR-615-5p靶向AKT1调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究》文中提出背景:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是一种侵袭性骨癌,目前骨肉瘤的治疗方法主要为基于相关指南的标准治疗方案,包括手术切除、化疗、靶向治疗以及放疗等。骨肉瘤患者的5年生存率大约为60～70%;局部进展期、转移或者复发患者的五年生存率仅为20%。令人遗憾的是,尽管放化疗、靶向治疗以及其他多种辅助治疗的方法已经在大多数患者中应用,但是骨肉瘤患者的术后生存时间并未发生显着延长。传统治疗方法在骨肉瘤的治疗方面受到了限制。通过寻找基于肿瘤患者遗传学或表观遗传学的异常改变的治疗靶点,为提高骨肉瘤治疗效果,改善患者预后提供了可能。这其中,Micro RNAs（mi RNAs）已经得到了广泛的研究,mi RNAs在肿瘤的发生和发展中既可能发挥促癌作用,又可能发挥抑癌功能。当某种mi RNAs是促癌基因时,其过表达将促进肿瘤的发展;相反,如果某种mi RNAs是抑癌基因,则其过表达将抑制肿瘤的发展。例如,mi R-135b、mi R-150、mi R-542-5p和mi R-652等已被证实在骨肉瘤细胞中异常表达。mi R-615-5p在肝癌、淋巴瘤和恶性胶质瘤等多种肿瘤组织中的表达水平下调,且这种异常表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等存在直接或间接关系。mi R-615-5p的靶目标包括AKT、IGF1/IGF2等。AKT1基因的生理功能为编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,有研究认为,AKT1的上调促进了骨肉瘤的肺转移,AKT1的下调能够明显抑制MAT1介导的骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭的促进作用,抑制异种移植裸鼠的肿瘤生长,减少转移性肺肿瘤的数量。因此,mi R-615-5p在多数肿瘤中具有显着的抑癌作用,AKT1信号通路在肿瘤的发生和发展过程中具有重要的作用,其在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的作用得到了确认,并且多种AKT1的调控因子已经被发现,但具体mi R-615-5p和AKT1在骨肉瘤中功能,以及两者相互作用关系仍有待进一步研究。目的:拟通过分子生物学实验探讨mi R-615-5p/AKT1调控轴在骨肉瘤中的表达水平,以及对骨肉瘤细胞生物学功能的影响。方法:收集29例2018年6月至2019年6月在我科手术治疗的骨肉瘤患者的癌变组织及癌旁正常组织。经中国科学院细胞研究所购买并培养骨肉瘤细胞（U2OS）及人正常成骨细胞（h FOB）。（1）q RT-PCR法检测癌变组织及癌旁正常组织、U2OS细胞及h FOB细胞中mi R-615-5p表达水平。（2）将U2OS细胞分为对照组、过表达组及无义对照组,分别用脂质体将mi R-615-5p模拟物及无义RNA转染至骨肉瘤U2OS细胞中,q RT-PCR检测细胞中mi R-615-5p表达水平,考察转染效率。（3）CCK-8法检测各组细胞活力及增殖情况。（4）划痕实验检测各组细胞侵袭能力。（5）Transwell实验检测各组细胞体外迁移能力。（6）通过生物信息学软件Targetscan7.2获取mi R-615-5p及AKT1的序列信息,考察二者序列是否具有片段性互补序列,分析二者可能存在的结合位点。（7）Western blot法检测三组细胞AKT1蛋白表达水平。（8）双荧光素酶报告实验检测mi R-615-5p和AKT1的结合关系。结果:（1）骨肉瘤对mi R-615-5p表达水平影响。（1）骨肉瘤组织中mi R-615-5p的相对表达水平低于癌旁正常组织,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）U2OS细胞中mi R-615-5p的相对表达水平低于h FOB细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）mi R-615-5p过表达对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。（1）过表达组mi R-615-5p的相对表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞的细胞活力和增殖能力显着抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞组的划痕愈合程度远低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞组的穿过小室细胞数量低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）考察mi R-615-5p通过AKT1影响U2OS细胞生物学行为的相关机制。（1）序列对比结果显示,mi R-615-5p与AKT1 3’-UTR存在结合位点。（2）mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞AKT1蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）双荧光素酶报告基因分析mi R-615-5p与AKT1表达相互作用结果显示,与Control组比较,在转染mi R-615-5p的细胞中,AKT1 3’-UTR WT的荧光素酶活性下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）mi R-615-5p在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系U2OS中低表达。（2）mi R-615-5p过表达可抑制U2OS细胞的增殖、迁移和侵袭能力。（3）AKT1是mi R-615-5p的直接靶点,mi R-615-5p可通过AKT1调控U2OS细胞的生物学行为。（4）本研究发现,mi R-615-5p可能是骨肉瘤的潜在分子治疗靶点。
杨小进[7]（2020）在《长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究》文中研究表明目的:结直肠癌是世界范围内最常见的第三种肿瘤类型,也是全球癌症相关致死的第四大因素。结直肠癌对人类健康构成了极大的威胁。结直肠癌的发病机制仍不明确,普遍认为是环境因素和基因遗传共同长期作用的结果。研究显示KRAS等多种肿瘤致病基因的突变、P53等抑癌基因突变和表观遗传学修饰、信号通路调节异常、非编码RNA对基因表达的多层面调控等多种因素均与结直肠癌的发生发展相关。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是非编码RNA的主要类型,是一种至少包含200个核苷酸且不编码蛋白的RNA,通过基因表达调控在结直肠癌的许多生物学过程中发挥着重要作用。LncRNA-DANCR被证明在多种肿瘤中扮演原癌基因的作用,但其在结直肠癌中的生物学功能和机理不清楚。方法:我们依托所在医院收集了 20对结直肠癌旁正常组织和癌组织,以及84个包含病人5年生存期的结直肠癌组织,然后利用RNA-FISH对结直肠癌组织和癌旁组织中DANCR的表达情况进行了检测。在此基础上,我们依据DANCR的表达情况对DANCR与病人预后的相关性进行了统计分析。我们利用定量PCR对正常人结直肠上皮细胞和多株结直肠癌肿瘤细胞中DANCR的表达情况进行了检测,并利用RNA-FISH对DANCR在结直肠癌细胞中的分布情况进行了检测。为研究DANCR对结直肠癌细胞生长的调控作用,我们利用慢病毒介导的shRNA特异性的敲除SW480和HCT15细胞中DANCR的表达,然后在细胞水平利用CCK-8实验、克隆形成实验、流式凋亡检测和Hoechst染色对细胞的增殖能力、克隆形成和凋亡情况进行了检测。在动物水平的研究中,我们利用稳定敲除DANCR的SW480和HCT15细胞分别建立了皮下移植瘤模型,然后绘制肿瘤生长曲线,统计肿瘤重量。在明确DANCR促进结直肠癌生长的作用的基础上,我们利用western blotting对稳定敲除DANCR的SW480和 HCT15 细胞中 Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、p53、cyto C、Bcl-2 和 Bcl-xL 的表达情况进行了检测;并利用免疫组化染色对SW480和HCT15皮下移植瘤组织中Caspase 3、p53和cyto C的表达情况进行了检测。结果:1)DANCR在结直肠癌组织中高表达,且与病人预后负相关:在对20对结直肠癌组织和癌旁正常组织的RNA-FISH染色结果表明DANCR在结直肠癌组织中显着高表达;DANCR在结直肠癌肿瘤细胞中高表达,且主要表达在细胞浆中;进一步的生存期分析表明DANCR高表达的结直肠癌病人常伴随更差的5年生存期。2)敲除DANCR通过促进细胞凋亡发生抑制结直肠癌细胞生长:利用慢病毒介导的shDANCR稳定感染SW480和HCT15细胞能显着抑制SW480和HCT15细胞中DANCR的表达;稳定敲除DANCR的表达在细胞水平上能显着抑制结直肠癌增殖和克隆形成,促进结直肠癌细胞凋亡发生;稳定敲除DANCR的表达在动物水平能通过促进结直肠癌皮下移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡的发生抑制结直肠癌细胞皮下移植瘤的生长。3)敲除DANCR促进线粒体相关凋亡蛋白和p53蛋白的表达:敲除DANCR促进 SW480 和 HCT15 细胞中 Caspase 3、Caspase 8 和 Caspase 9 蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多Caspase 3阳性的细胞;敲除DANCR促进SW480和HCT15细胞中p53蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多p53阳性的细胞;敲除DANCR促进SW480和HCT15细胞中Cyto C蛋白的表达,同时抑制Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多Cyto C 阳性的细胞。结论:DANCR在结直肠癌组织中高表达,其表达情况与结直肠癌病人的良好预后呈显着负相关。DANCR主要定位于结直肠癌细胞的胞浆中,敲除DANCR的表达能通过促进线粒体相关凋亡的发生来抑制结直肠癌细胞的生长。以上研究表明DANCR是一个结直肠癌治疗和预后的潜在靶点。
闫欢[8]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中研究说明研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
史湖波[9]（2020）在《雷帕霉素通过调节与自噬和肿瘤干细胞相关的通路抑制小鼠S180肉瘤生长》文中研究指明该博士论文由相对独立的两部分工作组成。第一部分雷帕霉素通过调节与自噬和肿瘤干细胞相关的通路抑制小鼠S180肉瘤生长背景:随着现代社会的不断发展,癌症在我国每年的新发病率呈上升趋势,同时死亡率也逐年增高,已经成为造成中国人口死亡的主要原因之一。我国幅员辽阔,人口数量庞大,约占世界总人口的20%左右,进入21世纪,出生率与死亡率比重逐步增大,在世界大环境下每年近有22%的新发恶性肿瘤患者以及27%的因为恶性肿瘤去世的患者。相应的恶性肿瘤治疗费用呈逐年增长趋势,已严重制约着社会的发展与进步。社会压力增加、环境污染、饮食模式趋向西方化、运动量减少、人口老龄化等多因素的叠加是导致发病率增加的主要原因。肉瘤的概念为起源于间充质成分的一组生物学表现比较特殊的瘤体,它是恶性肿瘤但是有别于我们常说的癌症。肉瘤的发病部位多位于表皮、皮下、骨组织、软组织、结缔组织等,肺内间质中也有肉瘤的发生,原发性肺肉瘤（primary pulmonary sarcoma,PPS）为来自于肺部比较不多见的呼吸系统的肉瘤,占国内肺部恶性肿瘤的0.7%～3.6%,肉瘤按照发病组织来源可分为平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维组织肉瘤、恶性间皮瘤等。肉瘤发病率虽低,但可以在任何年龄段发生,男性的患病人数比女性高,与肺癌、结直肠癌等常见癌症相比,发病人群趋于低年龄化的特点,在青年人、中年人中占的比重较高,其在发病的早期阶段容易发生血行转移,并且病情发展的速度快,生存质量不佳,对全身影响大,预后不佳。肉瘤对放疗和化疗不敏感,手术前后的辅助治疗在延长患者生存时间方面没有明显优势,外科干预的治疗方法还是对其比较有效的方式,做手术的目的就要尽最大努力对瘤体实现完整性切除,这对于预后有较大影响。因此,对肉瘤而言,靶向治疗是一种更加科学有针对性的治疗方式,肉瘤主要的基因突变情况有KRAS、PIK3CA、EGFR等,针对KRAS突变、EGFR突变对应的靶向药物分别是MEK抑制剂、TIKi类药物。mTOR抑制剂是针对PIK3CA基因改变信号通路的靶向药物。mTOR（mammalian target of rapamycin）是雷帕霉素的哺乳动物靶标,其具有两种复杂形式。也称作为mTORC1及mTORC2,mTOR信号通路的机制是参与肿瘤的发生过程,抑制肿瘤细胞的凋亡进程。同时增强细胞恶性程度,引起了肿瘤的生长、增殖,此外,mTOR为一种内源性存在的自噬过程中的抑制剂。肿瘤组织中也会有细胞凋亡发生,这一过程通过介导自噬进行。目前已研究出多种形式的mTOR抑制剂,其靶标涉及mTOR信号的各传导途径。雷帕霉素（rapamycin,RAPA）是通过与细胞内受体结合对mTORC1起作用,而对mTORC2无明显作用。雷帕霉素可以抑制IL1、IL2等生长因子及集落刺激因子的活化,抑制由于PI3K及Akt的过度激活导致的癌基因的活化,同时它还可以通过减少供应细胞的物质来源产生影响,可以限制周围血管的产生,切断游离通道并限制肿瘤细胞扩散。在黑色素瘤、横纹肌肉瘤、胰腺癌、白血病等肿瘤细胞的研究中均显示出了抑瘤效果。雷帕霉素阻断分裂周期进展,无法完成拷贝过程,并且已证明其促进凋亡进程。目的:目前有关雷帕霉素在肉瘤中的相关研究非常少,其功能及作用机制也尚未完全明确,因此对雷帕霉素在肉瘤中的抑制功能及作用机制进行研究具有重要的意义。本实验把靶向信号通路与自噬、肿瘤干细胞相关联,深入探讨雷帕霉素作用后对肉瘤生长的影响机制,为肉瘤治疗的药物适应性提供实验基础。方法:在该研究中,将S180肉瘤细胞进行细胞培养,通过流式细胞仪、CCK8试验检测不同浓度雷帕霉素对S180细胞凋亡的影响。Transwell实验检测雷帕霉素对S180细胞侵袭、迁移能力的影响。在动物实验中,使用小鼠S180肉瘤作为研究对象,以建立小鼠S180肉瘤细胞的荷瘤模型。后对小鼠进行不同浓度雷帕霉素药物处理,实验结束后,处死小鼠并分离肿瘤组织。利用HE染色后显微镜观察小鼠S180肉瘤组织病理学变化,并利用免疫组织化学通过激光共聚焦显微技术检测S180肉瘤组织中mTOR、Beclin1、LC3、ULK1、CD133、CD90、Notch1蛋白的表达与定位。利用Real-time PCR和Western blot分别检测体外培养细胞和肿瘤组织细胞中自噬相关蛋白mTOR、Beclin1、LC3（microtuble-associated protein light chain 3）、ULK1 和肿瘤干细胞标记物CD133、CD90、Notch1（unc-51 like autophagy activating kinase 1）的表达变化,从动物水平和细胞分子水平上探索研究雷帕霉素对S180肉瘤的作用机理。结果:1.雷帕霉素以剂量依赖的方式诱导S180肉瘤细胞凋亡流式结果显示不同浓度的雷帕霉素作用24h后,S180细胞凋亡增加,且随着雷帕霉素浓度的增加发生早期凋亡和晚期凋亡的细胞均显着增多。表明雷帕霉素以剂量依赖的方式诱导S180细胞发生凋亡。2.雷帕霉素抑制S180肉瘤细胞的迁移及侵袭。雷帕霉素作用后,S180细胞的迁移能力明显降低,且高浓度雷帕霉素作用组与对照组相比具有显着性差异。Transwell检测S180细胞侵袭结果显示雷帕霉素作用后,S180细胞的侵袭能力下降,且高浓度雷帕霉素作用组与对照组相比具有显着性差异。以上结果均提示雷帕霉素以剂量依赖的方式抑制了 S180细胞的迁移、侵袭能力。3.雷帕霉素抑制荷瘤小鼠S180肉瘤生长。雷帕霉素处理后小鼠皮下肿瘤的平均体积相对于对照组降低。雷帕霉素（2 mg/kg）可抑制肿瘤生长,但与未用药小鼠相比无显着性差异。雷帕霉素（4mg/kg）治疗组中,肿瘤生长被明显抑制。第14天,未用药组的平均肉瘤体积达到2298 mm3,而雷帕霉素4mg/kg处理后平均肉瘤体积1264 mm3。2 mg/kg和4 mg/kg雷帕霉素治疗组肿瘤生长抑制率分别为30.1%和48.8%。上述结果提示雷帕霉素对小鼠S180肉瘤生长的影响与药物用量相关。4.雷帕霉素可以促进小鼠S180肉瘤组织中细胞凋亡,且凋亡程度受药物用量的影响。荷瘤小鼠S180肉瘤组织经过HE染色后,未用药物作用组肉瘤组织的细胞呈现不规则生长,排列顺序呈现为片状及嵌套状。特别是,内核的形状,颜色和大小不同,核膜厚度不均匀。雷帕霉素作用后,小鼠S180肉瘤组织出现坏死及空泡,核固缩,并随着雷帕霉素作用浓度的增大,细胞坏死及空泡,核固缩的比例明显增多。5.雷帕霉素抑制mTOR表达,并促进S180肉瘤细胞中基因Beclin1、ULK1、LC3的表达。雷帕霉素作用于S180肉瘤细胞后,mTOR的表达降低,且4 mg/kg雷帕霉素组mTOR表达与对照组有显着性差异（p<0.05）,提示雷帕霉素抑制S180肉瘤组织中mTOR转录、表达,抑制程度受药物剂量的影响。免疫组化及免疫荧光检测显示,在S180肉瘤细胞中,Beclin1与LC3在细胞质与细胞膜上均有表达,ULK1和mTOR主要在细胞质中表达。在培养细胞及肿瘤组织中,Real-time PCR及Western blot检测显示,与对照组相比,雷帕霉素作用后,ULK1、Beclin1和LC3的mRNA及蛋白表达增加,且在4 mg/kg雷帕霉素组中ULK1、Beclin1表达与对照组相比具有显着性差异（p<0.05）,提示雷帕霉素能够促进ULK1、Beclin1的转录与表达。且LC3 Ⅱ/I蛋白的表达在高剂量及低剂量雷帕霉素作用组中均发生显着上调（p<0.05）。6.雷帕霉素抑制S180肉瘤细胞中CD90、CD133及Notch1蛋白的表达。免疫组化及免疫荧光检测显示,在S180肉瘤细胞中Notch1、CD133、CD90在细胞质与细胞膜上均有表达。在培养细胞及肿瘤组织中,应用Real-time PCR及Western blot检测显示,与未用药物组比较,经过不同浓度雷帕霉素作用后,S180肉瘤细胞中Notch1、CD133、CD90的mRNA及蛋白表达均发生下调,且在4mg/kg雷帕霉素组中其表达与无药物处理组有显着性差异（p<0.05）。提示雷帕霉素以剂量依赖的方式抑制S180肉瘤组织中CD90、CD133及Notch1的转录与表达。结论:雷帕霉素能够以剂量依赖的方式抑制小鼠S180肉瘤细胞的生长,杀死肿瘤,并诱导S180肉瘤细胞凋亡。雷帕霉素抑制S180肉瘤细胞的迁移及侵袭。雷帕霉素能可促进S180肉瘤细胞中Beclin1、ULK1、LC3转录、表达,并以剂量依赖的方式抑制mTOR、CD90、CD133及Notch1的转录与表达,表明雷帕霉素对小鼠S180肉瘤生长的抑制及凋亡的诱导可能与其促进自噬、抑制肿瘤干细胞标记物的表达相关。第二部分LACTB调控EMT抑制肺腺癌转移及侵袭的机制研究研究意义:肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,肺腺癌发病率约占原发性肺癌的25%,发病年龄较小,与肺鳞癌相比,恶性程度较大,容易出现远处转移。肺腺癌患者在治疗中对现行放疗和化疗不够敏感,预后较差,患者的5年总生存率很低,小于15%。因此,深入研究肺腺癌侵袭、转移机制,寻找肿瘤发展过程中的关键分子,将对今后进一步发现新的治疗靶点,实现肺腺癌的精准治疗具有重要意义。研究目的及方法:最近研究表明一种线粒体蛋白内酰胺酶β（LACTB）被报道具有抑癌功能,但在肺癌中其功能及作用机制尚未有相关报道。肺癌的上皮间质转化（EMT）与转移及复发密切相关,本研究的目的就在于探讨LACTB在肺腺癌中调控EMT、转移及侵袭的功能及作用机制。我们通过TCGA数据分析LACTB的mRNA在肺腺癌组织中的表达及启动子甲基化水平,分析LACTB表达与患者生存期的相关性。并对肺腺癌细胞中LACTB的表达进行检测,随后于肺腺癌细胞系中通过慢病毒过表达或干扰LACTB,利用MTT、划痕实验、Transwell等检测对细胞增殖、迁移的影响;检测对细胞EMT的影响,检测MMP2与EMT标志物等蛋白的表达及相关信号分子的变化,从而探讨LACTB对肺腺癌EMT及转移侵袭的调控机制。实验结果:1.LACTB的mRNA在肺腺癌中低表达,启动子甲基化水平增加,且LACTB表达与患者生存期正相关,LACTB低表达患者生存期显着少于高表达患者。2.LACTB过表达下调Snail抑制肺腺癌发生EMT,E-cadherin表达上调,N-cadherin与Vimentin表达下调;干扰LACTB表达后Snail表达上调促进肺腺癌EMT。3.LACTB过表达下调MMP2表达进而抑制肺腺癌细胞转移与侵袭;干扰LACTB表达后,MMP2表达上调,促进肺腺癌细胞转移与侵袭。实验结论:1.LACTB在肺腺癌中低表达且与患者生存期正相关;2.LACTB通过下调Snail抑制EMT,进而抑制肺腺癌转移与侵袭。
王发展[10]（2020）在《Naa10p调控Pirh2-p53信号通路在口腔鳞癌侵袭转移中的作用机制研究》文中提出目的通过研究Naa10p在OSCC中的表达以及在OSCC侵袭转移过程中发挥的作用,并阐明Naa10p通过调控Pirh2-p53信号通路影响OSCC侵袭转移分子机制。并依此为开发新型抗肿瘤转移药物提供一定的实验和理论依据,进一步提高和改善OSCC患者的治疗和预后。方法采用q RT-PCR、Western-Blot和免疫组化技术,检测Naa10p在OSCC患者肿瘤和瘤旁组织中的表达,并分析其与患者临床病理参数和预后的相关性。采用慢病毒体系,建立稳定干扰Naa10p的OSCC细胞株CAL 27以及SCC-15细胞,观察Naa10p表达变化后对细胞生长增殖、迁移、侵袭等的影响;分别将稳定干扰Naa10p的CAL 27细胞及对照组细胞接种于4-6周龄裸鼠左肋处皮下,通过裸鼠活体实验观察裸鼠注射入各组细胞后肿瘤大小、体积和重量,并绘制裸鼠的生存曲线。采用免疫组化检测OSCC患者肿瘤组织以及裸鼠成瘤组织中Naa10p、Pirh2和p53蛋白的表达并分析三者表达的相关性,以及采用Western-Blot检测CAL 27和SCC-15细胞中Naa10p对Pirh2-p53信号通路以及下游迁移侵袭蛋白MMP2、MMP9的表达调控关系。采用IP,GST-Pull Down和IF明确能与Naa10p相互作用蛋白NF-κB亚基Rel A/p65蛋白。荧光素酶报告基因实验检测Naa10p与该相互作用蛋白对Pirh2基因转录激活作用的影响。CHIP-q PCR检测Rel A/p65与Pirh2基因启动子区结合以及Naa10p对Rel A/p65结合Pirh2基因启动子区的影响。OSCC细胞运用小RNA干扰技术,分别下调Naa10p、Pirh2以及同时下调Naa10p和Pirh2后检测对OSCC细胞迁移侵袭的影响。结果1.免疫组化和q RT-PCR结果显示,OSCC组织中Naa10p的表达均显着高于癌旁组织;且其表达与患者TNM分期、淋巴结转移、分化程度以及复发之间相关。同时,Naa10p的表达与患者的OS和RFS呈正相关。2.Naa10p能够抑制OSCC细胞的迁移、侵袭、和生长增殖能力;且干扰Naa10p后促进裸鼠体内的肿瘤生长,并降低裸鼠生存期。3.Naa10p在OSCC中表达与Pirh2蛋白表达呈负相关,与p53蛋白表达呈正相关。4.OSCC细胞中Naa10p能与NF-κB的亚基Rel A/p65蛋白直接相互作用,且能抑制p65蛋白的磷酸化。5.Rel A/p65可转录激活Pirh2基因,且Naa10p能够抑制Rel A/p65转录激活Pirh2。6.截短Pirh2基因启动子区,Rel A/p65转录激活Pirh2基因启动子区S1片段的荧光素酶活性与全长Pirh2启动子相当。然而,截断体S2荧光素酶活性与对照组无显着差异,且Naa10p能够抑制Rel A/p65转录激活Pirh2基因启动子区S1片段的荧光素酶活性。7.Rel A/p65能够直接结合Pirh2基因的启动子区S1片段p65结合位点上,同时Naa10p能够抑制Rel A/p65直接结合到Pirh2基因的启动子区S1片段。8.Naa10p通过下调Pirh2的表达,抑制Pirh2对p53蛋白的降解,上调p53的表达进而抑制下游迁移侵袭相关蛋白MMP2、MMP9的表达,发挥抑制OSCC的迁移、侵袭的作用。结论1.Naa10p在OSCC中高表达,且其能够抑制OSCC细胞的迁移、侵袭,同时Naa10p可降低裸鼠体内的肿瘤生长,并延长裸鼠生存期。2.Naa10p通过调控Pirh2-p53信号通路进而抑制其下游迁移侵袭蛋白MMP2、MMP9的表达,发挥抑制OSCC迁移侵袭的作用。3.Naa10p能与NF-κB的亚基Rel A/p65直接相互作用,且抑制p65蛋白的磷酸化入核,减弱Rel A/p65结合到Pirh2基因功能启动子区S1片段激活Pirh2基因的转录。
二、p53抑癌基因蛋白过表达在肉瘤发生中作用的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、p53抑癌基因蛋白过表达在肉瘤发生中作用的研究（论文提纲范文）
（1）TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 免疫分子TIPE1对骨肉瘤细胞增殖等生物学行为的影响 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 TIPE1调控PRMT1/STAT3通路影响骨肉瘤增殖的分子机制研究 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 临床标本验证TIPE1抑制STAT3表达参与骨肉瘤发生 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（2）NPRL2基因转录水平调控及促进前列腺癌细胞增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 NPRL2 基因在前列腺癌组织中的生物信息学分析 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NPRL2 基因转录水平调控的分子机制 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NPRL2 基因对前列腺癌细胞增殖活性的作用及机制 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 NPRL2 基因促进前列腺癌增殖的分子机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 前列腺癌自噬相关基因预后模型的构建与分析 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:NPRL2 基因在恶性肿瘤中的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（3）陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结直肠癌(CRC)简述 |
| 1.2 microRNAs与CRC关系 |
| 1.3 LncRNAs与CRC关系 |
| 1.4 结直肠癌的早筛 |
| 1.4.1 目前用于平均风险人群的CRC筛查主要包括以下方法 |
| 1.4.2 microRNAs可作为肿瘤的早期筛查指标 |
| 1.5 MIR17HG及其在结直肠癌中的作用 |
| 1.6 本课题的研究目标和意义 |
| 第二章 LncRNAs,miRNAs及GREM1基因多态性与中国陕西汉族结直肠癌风险的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 统计分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 参与者的基本特征 |
| 2.3.2 HWE检验结果 |
| 2.3.3 等位基因分布及与CRC风险的关系 |
| 2.3.4 遗传模型下SNPs与CRC风险的关系 |
| 2.3.5 SNPs与CRC风险相关分层分析 |
| 2.3.6 SNPs与CRC临床特征相关性 |
| 2.3.7 单倍型与CRC风险的关系 |
| 2.3.8 多个SNPs交互作用的MDR分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 MIR137HG和MIR577多态性与CRC的关系 |
| 2.4.2 MIR143HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.3 MIR3142HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.4 LINC-PINT多态性与CRC的关系 |
| 2.4.5 MIR124-1HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.6 MIR608多态性与CRC的关系 |
| 2.4.7 H19和MIR675多态性与CRC的关系 |
| 2.4.8 MIR192、MIR618和MIR492多态性与CRC的关系 |
| 2.4.9 MIR17HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.10 GREM1 多态性与CRC的关系 |
| 2.4.11 MIR497HG、MIR423和MIR133A1HG多态性与CRC的关系 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 MIR17HG及其编码的micro RNAs在结直肠癌中的表达及临床信息关联的生物信息学分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 研究方法 |
| 3.2.3 统计方法 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 MIR17HG的泛癌分析 |
| 3.3.2 MIR17HG在结直肠癌中的表达与临床预后分析 |
| 3.3.3 miR-17-92a簇在结直肠癌与癌旁正常组织中的表达及临床预后分析 |
| 3.3.4 miR-17-92a簇在结直肠癌病例与健康对照,病例不同分期中血清中的表达及预后分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 miR-17-92a簇在大多数肿瘤及CRC中高表达 |
| 3.4.2 miR-17-92a簇的microRNAs在大多数肿瘤及结直肠癌组织中高表达 |
| 3.4.3 miR-17-92a簇的microRNAs在CRC病例血清中高表达 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 miR-17-92簇在结直肠癌病例与健康人群血清中的表达分析及诊断作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.4 统计学方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 研究对象基本特征 |
| 4.3.2 病例组与对照组血清学指标 |
| 4.3.3 血清中microRNA的相对表达量 |
| 4.3.4 CEA、AFP、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-92a-1诊断结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.3.5 CEA、AFP、hsa-miR-18a-5p联合诊断结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.3.6 各指标与结直肠癌分期的相关性分析 |
| 4.3.7 hsa-miR-18a-5p、CEA对早期结直肠的诊断的ROC曲线 |
| 4.3.8 各指标区分早晚结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 糖蛋白癌胚抗原和甲胎蛋白 |
| 4.4.2 miR-17-92a簇作为血清肿瘤诊断标志物的应用 |
| 4.4.3 hsa-miR-18a-5p作为血清肿瘤诊断标志物的应用 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 hsa-miR-18a-5p对结直肠癌细胞生物学功能的影响及候选靶基因分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要仪器及试剂 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.2.4 统计方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 hsa-miR-18a-5p在结直肠癌细胞系中表达上调 |
| 5.3.2 结直肠癌细胞中hsa-miR-18a-5p干预效果 |
| 5.3.3 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 5.3.4 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 5.3.5 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞凋亡的影响 |
| 5.3.6 结直肠癌表达差异基因及功能注释 |
| 5.3.7 hsa-miR-18a-5p靶基因及其预后分析 |
| 5.3.8 关键靶基因分析 |
| 5.3.9 靶基因LIF与hsa-miR-18a-5p结合位点预测 |
| 5.3.10 Western Blot检测LIF与hsa-miR-18a-5p表达关系 |
| 5.3.11 LIF功能预测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 hsa-miR-18a-5p促进肿瘤发生发展 |
| 5.4.2 hsa-miR-18a-5p抑制肿瘤发生发展 |
| 5.4.3 在不同发育阶段和不同组织学亚型的同一器官的癌症中已观察到hsa-miR-18a的相反作用 |
| 5.4.4 hsa-miR-18a-5p抑制结直肠癌的发生发展 |
| 5.5 结论 |
| 结语和展望 |
| 参考文献 |
| 附录1:基因与泛癌的相关性 |
| 附录2:HCT116细胞鉴定证明 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间的科研成果 |
| 个人简历 |
（4）microRNA-143和CBFB基因多态性与肺癌易感性的关系及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:microRNA-143/145启动子区rs3733845、rs3733846单核苷酸多态性与肺癌易感性的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象与资料收集 |
| 2.2 SNP的选择与生物功能预测 |
| 2.3 外周血基因组DNA的提取和SNP的分型 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 研究对象的一般资料 |
| 3.2 rs3733845和rs3733846基因分型与肺癌易感性之间的关系 |
| 3.3 rs3733845和rs3733846基因分型与肺腺癌易感性之间的关系 |
| 3.4 rs3733845和rs3733846基因分型与肺鳞癌易感性之间的关系 |
| 3.5 rs3733845和rs3733846基因分型与小细胞肺癌易感性之间的关系 |
| 3.6 rs3733845和rs3733846与环境危险因素之间的交互作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:CBFB基因单核苷酸多态性与中国非吸烟女性肺癌易感性的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象与资料收集 |
| 2.2 SNP的选择与生物功能预测 |
| 2.3 外周血基因组DNA的提取和SNP的分型 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 研究对象的一般资料 |
| 3.2 CBFB基因rs12598154和rs17768165基因分型与肺癌易感性的关系 |
| 3.3 rs12598154和rs17768165基因分型与肺腺癌易感性之间的关系 |
| 3.4 rs12598154和rs17768165基因分型与肺鳞癌易感性之间的关系 |
| 3.5 rs12598154和rs17768165基因分型与肺小细胞癌易感性之间的关系 |
| 3.6 rs12598154和rs17768165与环境危险因素之间的交互作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:miR-143-3p及CBFB在TCGA肺腺癌组织中的表达及预后探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.2 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TCGA肺腺癌数据集中miR-143-3p表达与肺腺癌患者预后的关系 |
| 3.2 TCGA肺腺癌数据集中miR-143-3p的相对表达情况 |
| 3.3 与肺腺癌预后相关的影响因素 |
| 3.4 miR-143-3p靶基因筛选及验证 |
| 3.5 TCGA肺腺癌数据集中CBFB的相对表达情况 |
| 3.6 TCGA肺腺癌数据集中CBFB表达与肺腺癌患者预后的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分:肺腺癌中miR-143-3p调控路径探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验所需细胞系 |
| 2.2 实验所需主要试剂 |
| 2.3 实验所需主要仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-143-3p在肺腺癌细胞系中的相对表达量 |
| 3.2 miR-143-3p调控肺腺癌细胞的增殖 |
| 3.3 miR-143-3p调控肺腺癌细胞的迁移 |
| 3.4 miR-143-3p调控肺腺癌细胞的凋亡 |
| 3.5 miR-143-3p与p53 通路的相关性 |
| 3.6 miR-143-3p靶基因验证 |
| 3.7 miR-143-3p靶向抑制CBFB mRNA及蛋白表达 |
| 3.8 miR-143-3p通过调控CBFB靶基因干扰细胞增殖 |
| 3.9 miR-143-3p通过调控CBFB靶基因干扰细胞迁移 |
| 3.10 miR-143-3p通过调控CBFB靶基因干扰细胞凋亡 |
| 3.11 CBFB在肺腺癌细胞系中的相对表达量 |
| 3.12 CBFB调控肺腺癌细胞的增殖 |
| 3.13 CBFB调控肺腺癌细胞的迁移 |
| 3.14 CBFB调控肺腺癌细胞的凋亡 |
| 3.15 CBFB与p53的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究的创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 miR-143在肿瘤中功能的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）miR-552通过靶向p53调控喉癌细胞生长、转移和干性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 化学和生物试剂 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 病毒、质粒以及寡聚核糖核酸 |
| 2.1.7 喉癌组织样本 |
| 2.1.8 主要缓冲液 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.1 实验装置 |
| 2.2.2 测量软件 |
| 2.2.3 统计学分析软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 构建稳定细胞株 |
| 2.3.3 抽提总RNA |
| 2.3.4 逆转录 PCR(Reverse-Transcription PCR) |
| 2.3.5 实时荧光定量 PCR(Real-Time PCR) |
| 2.3.6 细胞增殖实验 |
| 2.3.7 流式细胞仪分选(Flow Cytometry, FCM) |
| 2.3.8 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.3.9 细胞低粘附成球培养 |
| 2.3.10 体外有限稀释实验 |
| 2.3.11 体内有限稀释实验 |
| 2.3.12 细胞迁移和侵袭实验 |
| 2.3.13 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.3.14 蛋白质电泳(Western blot) |
| 2.3.15 siRNA干扰实验 |
| 2.3.16 异种移植瘤形成实验 |
| 2.3.17 裸鼠尾静脉注射肺转移模型实验 |
| 2.3.18 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-552 在喉癌组织和细胞中表达上调 |
| 3.2 miR-552 促进喉癌细胞增殖 |
| 3.3 miR-552 促进喉癌细胞迁移和侵袭 |
| 3.4 miR-552 促进喉癌干细胞的自我更新和体内成瘤 |
| 3.5 miR-552 在喉癌细胞中直接靶向调控p53 的表达 |
| 3.6 p53 沉默可减弱miR-552 敲减喉癌细胞与其对照喉癌细胞生长、转移和自我更新能力的差异 |
| 3.7 p53 过表达可减弱miR-552 敲减喉癌细胞与其对照喉癌细胞生长、转移和自我更新能力的差异 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤中 miRNAs 表达失调机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 1 略缩词表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）MiR-615-5p靶向AKT1调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 一、骨肉瘤及MIRNAS |
| 二、MIR-615及其生物学功能研究简介 |
| 三、AKT1生物学功能及调控因子研究 |
| 四、本研究目的及意义 |
| 第一部分 骨肉瘤组织及细胞中MIR-615-5P表达水平研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 MIR-615-5P过表达对骨肉瘤细胞生物学行为的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 MIR-615-5P通过AKT1 影响U2OS细胞生物学行为的相关机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MIRNAS在骨肉瘤中的作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（7）长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料及主要试剂 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.3.2 慢病毒制备及感染细胞 |
| 2.3.3 RNA提取 |
| 2.3.4 RNA的质量检测 |
| 2.3.5 定量PCR实验 |
| 2.3.6 蛋白提取 |
| 2.3.7 BCA蛋白定量 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.3.9 细胞增殖活性检测 |
| 2.3.10 细胞克隆形成实验 |
| 2.3.11 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.12 Hoechst染色检测细胞凋亡 |
| 2.3.13 皮下移植瘤实验 |
| 2.3.14 TUNEL实验 |
| 2.3.15 免疫组化实验 |
| 2.3.16 FISH染色(细胞爬片) |
| 2.3.17 FISH染色(结直肠癌组织) |
| 2.3.18 siRNA瞬时转染 |
| 2.3.19 质粒瞬时转染 |
| 2.3.20 统计分析 |
| 实验结果 |
| lncRNA-DANCR在结直肠癌中高表达 |
| lncRNA-DANCR表达情况与结直肠癌进展相关 |
| lncRNA-DANCR在结直肠癌细胞中高表达,定位于胞浆中 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌细胞生长 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞凋亡的发生 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌皮下移植瘤生长 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤中细胞凋亡发生 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞中Caspase凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤组织中Caspase凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞中p53蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤组织中p53蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制调控结直肠癌细胞中线粒体相关凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达调控结直肠癌皮下移植瘤组织中线粒体相关凋亡蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结直肠癌相关长链非编码RNA研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论文 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
（8）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）雷帕霉素通过调节与自噬和肿瘤干细胞相关的通路抑制小鼠S180肉瘤生长（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 雷帕霉素通过调节与自噬和肿瘤干细胞相关的通路抑制小鼠S180肉瘤生长 |
| 第一章 自噬与肿瘤干细胞的研究新进展 |
| 一、肿瘤概述 |
| 二、肿瘤的治疗方式 |
| 1 外科手术治疗 |
| 2 化疗 |
| 3 放射治疗 |
| 4 分子靶向治疗 |
| 5 免疫治疗 |
| 6 物理性靶向治疗 |
| 三、自噬和肿瘤干细胞研究的新进展 |
| 1 自噬与肿瘤 |
| 2 肿瘤干细胞与肿瘤 |
| 3 肿瘤干细胞的自噬和肿瘤的治疗 |
| 四、结语 |
| 第二章 雷帕霉素通过调节与自噬和肿瘤干细胞相关的通路抑制小鼠S180肉瘤生长 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验步骤 |
| 3 统计分析 |
| 三、实验结果 |
| 1 雷帕霉素以剂量依赖的方式诱导S180细胞凋亡 |
| 2 雷帕霉素抑制S180细胞的迁移及侵袭 |
| 3 雷帕霉素能够抑制荷瘤小鼠S180肉瘤的生长 |
| 4 雷帕霉素能够诱导荷瘤小鼠S180肉瘤细胞凋亡 |
| 5 雷帕霉素能够诱导荷瘤小鼠S180肉瘤细胞自噬 |
| 6 雷帕霉素抑制荷瘤小鼠S180肉瘤细胞的肿瘤干细胞特性 |
| 四、讨论 |
| 1 雷帕霉素抑制S180肉瘤生长 |
| 2 雷帕霉素促进自噬细胞死亡 |
| 3 雷帕霉素抑制肿瘤干细胞标记物表达 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LACTB调控EMT抑制肺腺癌转移及侵袭的机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验步骤 |
| 3 统计分析 |
| 三、实验结果 |
| 1 LACTB在肺腺癌中低表达,且与患者生存期正相关 |
| 2 LACTB过表达抑制肺腺癌细胞EMT |
| 3 稳定过表达LACTB抑制肺腺癌细胞的迁移与侵袭 |
| 4 干扰LACTB表达促进肺腺癌细胞EMT |
| 5 干扰LACTB促进肺腺癌细胞的转移与侵袭 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 外文论文 |
| PAPER Ⅰ |
| PAPER Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）Naa10p调控Pirh2-p53信号通路在口腔鳞癌侵袭转移中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 Naa10p在 OSCC组织中高表达并与预后呈正相关 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二部分 Naa10p抑制OSCC细胞的侵袭转移及在裸鼠体内的肿瘤生长 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分 Naa10p调控Pirh2-p53 信号通路抑制OSCC侵袭转移的机制研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 表1 引物和干扰片段信息一览表 |
| 表2 抗体信息一览表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
四、p53抑癌基因蛋白过表达在肉瘤发生中作用的研究（论文参考文献）
- [1]TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究[D]. 刘光平. 山东大学, 2021(12)
- [2]NPRL2基因转录水平调控及促进前列腺癌细胞增殖的机制研究[D]. 胡代星. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究[D]. 陈鹏. 西北大学, 2021(12)
- [4]microRNA-143和CBFB基因多态性与肺癌易感性的关系及机制研究[D]. 杨香琳. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]miR-552通过靶向p53调控喉癌细胞生长、转移和干性的研究[D]. 谷佳. 中国医科大学, 2021
- [6]MiR-615-5p靶向AKT1调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究[D]. 范人杰. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(06)
- [7]长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究[D]. 杨小进. 苏州大学, 2020(06)
- [8]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [9]雷帕霉素通过调节与自噬和肿瘤干细胞相关的通路抑制小鼠S180肉瘤生长[D]. 史湖波. 山东大学, 2020(10)
- [10]Naa10p调控Pirh2-p53信号通路在口腔鳞癌侵袭转移中的作用机制研究[D]. 王发展. 石河子大学, 2020(08)