一、葡萄糖调节蛋白的生物学特性及其在应激免疫应答中的作用（论文文献综述）
刘洋[1]（2021）在《不同免疫状态下鸡miRNA的表达特性及机制研究》文中认为miRNA是一类参与免疫调控的重要影响因子,循环miRNA在反映机体状态和成为分子标记物方面具有重要的研究价值。目前,关于循环miRNA在免疫应答和应激性免疫抑制中的动态表达规律未见报道。本研究以鸡为模式动物,利用新城疫病毒（NDV）La Sota疫苗和地塞米松（Dex）分别制备免疫应答模型和应激性免疫抑制模型,采用荧光定量颈环RT-PCR技术,对机体不同免疫状态下的15种NDV相关的血清循环miRNA（miR-124、miR-19b、miR-126、miR-199、miR-375、miR-30、miR-122、miR-22、miR-20、miR-34、miR-200b、miR-29b、miR-451、miR-198和miR-31）进行表达规律分析,选取3种差异表达的miRNA（miR-375,miR-19b和miR-20）进一步分析其在组织中的时空表达规律,并用生物信息学预测其分子机制。主要研究结果如下:正常雏鸡NDV疫苗免疫应答过程中,免疫后的2-3天（dpi）和14-28dpi是血清循环miRNA响应NDV免疫应答的关键时期;应激性免疫抑制雏鸡中,2dpi和14dpi～28dpi是Dex诱导的大部分循环miRNA明显上调的时间点,7dpi的相对表达活性都较低;而在应激性免疫抑制雏鸡进行NDV疫苗免疫过程中,血清循环miRNA的差异表达时间点主要集中在2dpi和5dpi,且7dpi-21dpi的相对表达活性都较低。应激性免疫抑制能够使血清循环miRNA对NDV的响应关键时间点由正常机体的2dpi-3dpi和14dpi-28dpi转变为2dpi和5dpi,并抑制血清循环miRNA在NDV疫苗特异性免疫应答（7dpi-21dpi）的表达。正常雏鸡NDV疫苗免疫应答过程中,miR-375参与法氏囊（2dpi和21dpi）,心、肺和胸腺（2dpi）,脾和血细胞（14dpi）中的免疫调控过程,且法氏囊在2dpi、5dpi、14dpi和21dpi时可能是影响血清循环miR-375的表达水平的关键器官;应激性免疫抑制雏鸡中,miR-375是胸腺和法氏囊（5dpi）,脾脏和腺胃（14dpi）,血细胞（5dpi和14dpi）参与应激性免疫抑制调控的重要影响因子,2dpi的法氏囊可能是影响血清miR-375变化的关键器官;应激性免疫抑制雏鸡进行NDV疫苗免疫过程中,心、胸腺和法氏囊（2dpi）,小肠、结肠、脾脏和血细胞（14dpi）是免疫抑制条件下miR-375积极响应NDV免疫应答的器官,且2dpi的法氏囊可能是影响血清miR-375变化的关键器官。生物信息学分析表明,miR-375可能主要通过调控QKI、ELAVL4、PAX6、RPBPJ、TCPK、TCF12、TCCH2、KAF4、NR5A2、PIAS1形成的蛋白网络参与免疫调控过程。正常雏鸡NDV疫苗免疫应答过程中,miR-19b通过结肠和腺胃（2dpi）、法氏囊（2dpi和21dpi）参与NDV免疫应答过程;应激性免疫抑制雏鸡中,miR-19b通过参与心脏和法氏囊（2dpi）、胸腺（5dpi）、血细胞（14dpi）、结肠（21dpi）的免疫调控来应答Dex引起的应激性免疫抑制。应激性免疫抑制雏鸡进行NDV疫苗免疫过程中,2dpi的法氏囊和腺胃、5dpi的心、14dpi的小肠和结肠是miR-19b此过程中关键的免疫应答器官。生物信息学分析表明,miR-19b可能主要通过调控RNF11、FBXO30、ITCH、KLHL11、SMURF1、SMURF2、CBLB、LONRF1、MYLIP、HECW2、KBTBD8、WWP1形成的蛋白网络影响多种免疫过程。正常雏鸡NDV疫苗免疫应答过程中,miR-20可能通过结肠（2dpi）和法氏囊（21dpi）发挥着重要的免疫调节功能;应激性免疫抑制雏鸡中,miR-20通过心、结肠和盲肠扁桃体（2dpi）、胸腺（5dpi）、血细胞（14dpi）积极参与应激性免疫抑制过程;应激性免疫抑制雏鸡进行NDV疫苗免疫过程中,2dpi的结肠、14dpi的小肠和结肠是miR-20参与此过程的关键的免疫应答器官。生物信息学分析表明,miR-20可能主要通过调控RNF6、NEDD4L、FBXW11、FBXO30、HECTD2、MKRN1、TRIM36、MYLIP、FBXL5蛋白网络介导的泛素化过程参与机体免疫功能调控。本研究对不同免疫状态下15种NDV相关血清循环miRNA的表达特性进行分析,发现应激性免疫抑制能够改变NDV疫苗免疫通路中miRNA的时空表达特性,而且预测出3种关键miRNA参与免疫调控的可能作用机制,结果表明miRNA是影响免疫应答和应激性免疫抑制的重要调节因子。本研究为深入研究应激性免疫抑制与免疫反应的分子作用机制和开发以miRNA为靶标的家禽免疫状态辅助检测技术提供理论参考。
牟唐维[2]（2021）在《利用突变技术对HSV2 RL1、UL41和US12蛋白在病毒致病中的生物学机制研究》文中研究表明单纯疱疹病毒2型是引起生殖器疱疹的主要病原体之一,在免疫缺陷患者中可引起疱疹性脑炎和更严重的性传播疾病,该病毒可经性传播和母婴传播。HSV-2感染后可经感觉神经轴逆行至骶背根神经节建立潜伏感染,这种潜伏感染在受到外界刺激时,可以表现为显性感染出现症状。反复感染给患者造成了生理和心理的影响,严重影响生活质量。由于这种潜伏和反复感染导致HSV-2的治疗药物和疫苗研发困难重重。另外,感染HSV-2后可增加感染HIV的感染几率。因此研究HSV-2感染宿主后的致病机制、宿主的免疫反应以及病毒蛋白与宿主之间的相互作用有助于HSV-2治疗药物和疫苗的研发以及我们对HSV-2的致病机理更深入的理解。基于以上事实,本试验第一部分工作围绕与HSV-2免疫逃逸相关基因RL1、UL41、US12开展,首先利用CRISPR/Cas9系统构建HSV-2突变株:M2（HSV-2 RL1-UL41-）、M3（HSV-2RL1-US12-）、M4（HSV-2RL1-UL41-US12-）,随后对这三个突变株在细胞和动物试验中进行生物学特性分析,包括增殖动力学检测、蚀斑检测,急性感染、潜伏感染和免疫原性分析。结果表明,M2、M3、M4在细胞水平以及动物水平的急性感染、潜伏感染中都表现出增殖能力下降,且引起较轻的临床症状,其中M4增殖能力下降最为明显;免疫原性分析试验中发现,虽然突变株组能降低病毒的复制能力,但是不能100%保护,其中M4组存活率为90%,M2/M3组存活率均为80%。鉴于这一发现,本试验第二部分工作对野毒株和突变株M1（HSV-2RL-）、M2、M3感染后小鼠阴道、子宫和卵巢进行转录组测序分析。结果显示,与野毒株相比,最有意思的是突变株M1、M2、M3在阴道、子宫和卵巢组织中均能激活代谢信号通路,其中类固醇激素代谢信号通路和细胞色素代谢信号通路最为明显,且比较后发现,M1对类固醇激素代谢信号通路和细胞色素代谢信号通路影响较大,其可能的机制与RL1抑制细胞对病毒感染产生的应激翻译阻滞的特性相关,其中包括类固醇激素激素和细胞色素代谢过程。综上所述,对突变株M2、M3、M4在细胞和动物试验中比较和分析,筛选得到了一株复制能力较低、致病能力较低、潜伏感染能力较低以及具有一定的免疫保护作用的M4减毒株,可作为HSV-2减毒活疫苗的候选株。转录组学数据分析发现,M1突变株对类固醇激素代谢和细胞色素代谢具有较大影响,但是继续缺失UL41/US12时,该影响受到了限制,说明病毒蛋白之间也有一个互相平衡的状态。但是不可否认的是,RL1的缺失对类固醇激素代谢和细胞色素代谢具有重要影响,这一发现为HSV-2的感染过程中病毒蛋白与宿主之间的相互作用提供了新的研究方向。
霍达[3]（2020）在《刺参应对高温低氧胁迫的生理响应与分子调控特征》文中进行了进一步梳理仿刺参（Apostichopus japonicus）,又名刺参,属于棘皮动物门（Echinodermata）,主要分布在中国北部沿海及北太平洋西部浅海地区,是我国重要的海水养殖物种之一,并且在世界贸易中占据越来越重要的地位。温度和溶解氧是刺参水产养殖中最重要的两个非生物限制因素。近年来,在中国沿海水域和池塘中的刺参由于极端环境大量死亡,造成极为惨重的经济损失和资源破坏,限制了刺参水产养殖业的可持续发展。且在全球气候变化及人类活动加剧的大背景下,水域高温低氧现象正呈现常态化趋势。因此,迫切需要了解海洋生物对环境变化的响应机制。为探明极端天气下水体高温低氧环境对机体生理行为及分子调控等各方面的影响,本研究将刺参作为一种典型的棘皮动物模型,研究其对逆境的响应机制。利用控温棒及水体溶解氧实时控制系统模拟水体高温和低氧环境,通过测序技术辅以实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR或q PCR）验证,获得了刺参在应对高温低氧胁迫过程中m RNA、长非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）、micro RNA（mi RNA）、蛋白质、代谢物及关键免疫因子的变动与调控特征,并通过测定关键酶活性以及行为观察等方法获得了刺参生理行为方面的响应特征。主要研究结果如下:1.生理行为响应特征为探查高温低氧环境胁迫对刺参生理行为层面的响应特征,本项研究选取了与消化功能、免疫防御、氧化应激相关的16种酶进行活力测定。环境胁迫下刺参中α-淀粉酶（AMS）、胃蛋白酶（PEP）、胰蛋白酶（TRY）、脂肪酶（LPS）等消化相关酶活显着降低,消化功能可能受到潜在的负面影响。受到环境胁迫后刺参诱导了体内的免疫防御机制,酸性磷酸酶（ACP）和溶菌酶（LZM）活性显着增加,非特异性免疫增强。过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、酚氧化酶（PPO）等氧化应激相关酶,在机体遭受环境胁迫时,活力发生改变,以清除O2-、H2O2、OH-等物质,共同组成了刺参活性氧防御系统,减弱刺参氧化应激压力。此外,环境胁迫下刺参的分布状态、运动速度、排泄摄食等发生改变;低氧胁迫下刺参多集中于水表面分布,机体形态、体壁及内脏状况发生改变,包括吸水胀大、体表溃烂等。且较单因素胁迫相比,双因素协同作用下,刺参的耐受性急剧下降。实验结果表明刺参机体为适应极端环境综合调节消化、免疫、氧化应激等相关酶类,形成一系列适应性机制,同时改变行为以响应逆境。2.m RNA（message RNA）和lnc RNA（long non-coding RNA）响应特征为探究lnc RNA和m RNA的响应特征,本项研究获取了在高温胁迫（HT）、低氧胁迫（LO）、高温低氧胁迫（HL）以及正常对照处理条件（NC）下刺参呼吸树的lnc RNA和m RNA表达谱。在高温、低氧和高温低氧胁迫下分别鉴定出159、355和495个显着上调的基因以及230、518和647个显着下调的基因,并基于此构建了差异lnc RNA-m RNA共表达网络。其中,三种处理组中共识别出的关系对共有8对,并且根据连接程度,MSTRG.27265、MSTRG.19729和MSTRG.95524被证明是关键的lnc RNA。基于测序数据和real-time PCR验证的显着变化的lnc RNA中,有4个lnc RNA（MSTRG.34610、MSTRG.10941、MSTRG.81281和MSTRG.93731）均与之前研究中鉴定出的刺参低氧响应的关键mi RNA（Aja-mi R-2013-3p）具有结合位点;低氧诱导因子（HIF-1α）也显示为Aja-mi R-2013-3p的潜在靶向目标。双萤光素酶报告系统验证结果显示,“HIF-1α/Aja-mi R-2013-3p/MSTRG.34610”网络和“HIF-1α/Aja-mi R-2013-3p/MSTRG.10941”网络在刺参应对环境胁迫时可能发挥重要作用。环境胁迫通过改变lnc RNA和m RNA的表达水平,进而影响刺参的免疫、能量代谢和细胞周期等各种生物学过程。与单因素胁迫相比,高温低氧协同胁迫能引起刺参分子水平上更加广泛的响应。3.micro RNA响应特征为探究三种类型的环境胁迫对刺参中mi RNA表达的影响,本项研究鉴定并表征了差异表达的mi RNA,并查明了其主要参与的生物学过程。与对照组相比,高温、低氧和高温低氧胁迫处理组分别鉴定出21、26和22个差异表达的mi RNA（DE-mi RNA）,在三种处理组中共有54种非重复性差异表达mi RNA。利用比较组学分析及real-time PCR,鉴定并验证代表性响应mi RNA。表征了在刺参应对高温应激（热应激）中发挥潜在关键作用的五个mi RNA包括Aja-mi R-novel-299、Aja-let-7b-3p、Aja-mi R-71b-5p、Aja-mi R-novel-13218和Aja-mi R-2004;以及在刺参应对低氧应激中可能发挥关键作用的Aja-mi R-92b-3p、Aja-mi R-210-5p和Aja-mi R-novel-26331。鉴定出的差异表达mi RNA参与了与生物合成、代谢、免疫、细胞凋亡和信号转导有关的多个关键生物学过程,从而影响了刺参的机体状态。4.蛋白水平响应特征为阐明环境胁迫下刺参中蛋白质水平的响应,本项研究基于比较蛋白质组学分析,利用同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ）,获取了高温和低氧单个及协同胁迫下的刺参呼吸树蛋白质表达谱,共鉴定出8437种蛋白质。其中高温、低氧及高温低氧胁迫下分别有262、155和433个差异响应蛋白。在高温低氧双因子共胁迫下,在刺参中鉴定出的差异调节蛋白多余单个胁迫,表明在蛋白质组水平上双因素协同胁迫具有累加效应。基于差异蛋白的基因本体论（Gene ontology,GO）分析表明,环境胁迫下,免疫响应相关蛋白上调,蛋白合成能力受到抑制;能量类物质如氨基酸、碳水化合物、脂类代谢过程发生改变;低氧胁迫诱导刺参中参与铁稳态的蛋白上调,糖原合成相关蛋白下调;高温胁迫及高温低氧胁迫下刺参中糖异生过程上调。刺参采取不同的策略应对不同的环境胁迫,主要包括“物质生物合成、运输和代谢”、“信号转导”、“蛋白质合成”、“免疫和防御反应”以及“能量产生和转化”等方面。5.代谢物响应特征为探究逆境下刺参中代谢物变动特征,本项研究利用超高效液相色谱-质谱（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,UPLC-MS）获得刺参响应于不同形式的环境胁迫的代谢组学变化。在高温、低氧和高温低氧双胁迫下的刺参中分别观察到84、68和417种代谢物浓度发生显着改变,说明双环境因子协同胁迫对刺参呼吸树代谢产物的影响比单一胁迫更为广泛。研究确定了刺参中潜在的十种高温胁迫生物标志物和十种低氧胁迫生物标志物,包括德尔塔林、镰刀菌素C、环吡阿尼酸、顶羽菊内酯、蛇孢菌素A、软海绵素B、苦艾素、紫金牛醌和杀菌素等。结果表明,环境胁迫下刺参中氨基酸、碳水化合物、脂质、辅酶因子和维生素以及核苷酸有关的代谢过程产生了响应,使刺参得以维持基本的生存。具体而言,高温胁迫导致涉及氨基酸、脂类、辅酶和维生素代谢的代谢产物发生变化、碳水化合物代谢减少;当暴露于低氧环境时,刺参中涉及氨基酸、碳水化合物代谢和脂肪酸代谢的产物水平显着增加。此外,三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle,TCA cycle）中的关键代谢物及参与能量代谢调节的代谢物水平发生了显着变化。推定热应激是干扰刺参中谷氨酸-谷氨酰胺代谢过程的主要因素。这些结果将有助于了解水生动物对不利环境的响应机制。6.免疫基因时序响应特征前几部分的实验结果显示,环境胁迫下刺参的免疫发生了响应。为探究刺参免疫基因对环境胁迫的时序响应特征,本项研究分别分析了暴露于高温和低氧两种环境下8个时间点的刺参中与核因子κB（NF-κB）通路、蛋白酶家族、补体系统、热休克蛋白（HSPs）和转铁蛋白家族有关的17个基因的表达水平。这些基因具有相互关联的作用,共同构成环境胁迫下刺参的免疫防御网络。实验结果表明刺参中与NF-κB通路和热休克蛋白家族相关的基因表达水平受到高温胁迫的强烈影响;而黑素转铁蛋白（Mtf）、铁蛋白（Ft）和甘露聚糖结合C型凝集素（MBCL）的表达水平则受到低氧的显着影响。相比之下,在环境胁迫初期,补体因子B（Bf）、肌球蛋白V（Mys）和丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI）基因在早期对胁迫并不敏感。在刺参受到高温和低氧胁迫时,一些基因具有相似的表达模式,包括Hsp90和溶菌酶（LZM）的表达增加以及主要蛋黄蛋白（MYP）和组织蛋白酶C（CTLC）的表达减少;与之相反,NF-κB和Hsp70在两种胁迫处理下的表达趋势不同。另外LZM诱导的免疫防御在刺参应对胁迫时可较为灵活地发挥作用。实验结果表明,刺参对不同类型的胁迫表现出复杂且多样的免疫反应。这些结果为研究环境胁迫下海洋生物响应提供免疫指标参考,有助于了解刺参在全球气候变化下的适应策略。
张卫[4]（2020）在《三种大豆蛋白源致珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Elanceolatus♂）肠道黏膜屏障损伤的差异机制研究》文中研究指明珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）作为典型的海水肉食性名贵鱼类,在养殖过程中发现过量的植物蛋白替代鱼粉易造成其肠道健康问题。本研究以其为实验对象（初重12.55±0.05g）,分别采用20%、40%普通豆粕（SBM）、大豆浓缩蛋白（SPC）和发酵豆粕（FSBM）替代鱼粉配制等氮等脂实验饲料,饲喂10周;基于常规鱼类营养生理、转录组学和代谢组学技术,探究三种大豆蛋白源对珍珠龙胆石斑鱼肠道黏膜屏障影响,主要研究结果如下:1.普通豆粕对珍珠龙胆石斑鱼肠道黏膜屏障损伤的机制研究720尾石斑鱼随机分为3组（n=4）:鱼粉对照组（FM）、20%SBM组（SBM20）和40%SBM组（SBM40）,配制3种等氮（50%粗蛋白）等脂（10%粗脂肪）饲料饲喂10周。结果发现:与FM组相比,（1）实验组增重率（WGR）、特定生长率（SGR）随SBM替代水平增加依次显着降低（P<0.05）;（2）半定量分析显示,SBM40组肠道炎症表征非常严重,SBM20组次之;后肠水通道基因1（Aqu1）,Aqu4,Aqu8,Aqu9,Aqu10和Aqu12和离子转运载体Guanylin,nkaα-1和clc的基因表达水平显着降低;紧密连接蛋白基因occludin,claudin3和ZO-1基因表达水平显着升高;（3）后肠胰蛋白酶（Trypsin）活性随SBM替代水平增加呈显着上升趋势;（4）后肠抗氧化酶活性（总超氧化物歧化酶T-SOD、谷胱甘肽还原酶GR、谷胱甘肽过氧化物酶GPx）随SBM替代水平升高呈显着上升趋势;后肠促炎性基因IL1β,IL8,IL12,IL17,IL32,TNFα和CSF1的表达水平呈显着升高趋势,反之,抗炎性基因IL4,IL5,IL10,TGFβ1基因表达水平呈呈显着下降趋势;（5）16S高通量测序显示,在门水平上,相对丰度前10的物种分别为变形菌门（Proteobacteria）,厚壁菌门（Firmicutes）,拟杆菌门（Bacteroidetes）,放线菌门（Actinobacteria）和蓝藻细菌门（Cyanobacteria）等。Proteobacteria丰度在SBM40组显着下降,而Firmicutes,Bacteroidetes和Actinobacteria丰度在SBM40组显着升高。在属水平上,相对丰度前10的物种分别为发光杆菌属（Photobacterium）,粪杆菌属（Faecalibacterium）,寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）,弧菌属（Vibrio）和奈瑟菌属（Neisseria）等。Faecalibacterium,Stenotrophomonas,Vibrio,Neisseria,拟杆菌属（Bacteroides）,链球菌属（Streptococcus）等丰度在SBM40显着升高;（6）转录组差异基因趋势分析发现,有1296个基因（记为基因集Profile A）呈显着上升趋势;677个基因（记为基因集Profile B）呈显着下降趋势。代谢通路KEGG富集发现,Profile A中显着富集到的与免疫疾病/系统、感染病和信号转导有关的占55.17%;Profile B中显着富集到的与免疫疾病/系统（Immune diseases/system）、感染病（Infectious diseases）和信号转导（Signal transduction）有关的仅占6.98%,与营养物质吸收代谢相关的占67.44%。转录组分析发现,TLR-My D88-NF-κB通路在SBM诱导的珍珠龙胆肠炎中发挥了重要作用;（7）代谢组学分析显示,珍珠龙胆肠道内容物和肠道组织中,分别有14种和13种较为保守的豆粕诱导型肠炎“核心生物标志物”,其中异黄酮类和皂苷类占据较大比例,大部分标志物间具有显着正相关或负相关作用;肠道内容物代谢组学和肠道组织代谢组学间反相关分析发现,包括不饱和脂肪酸、有机酸、氨基酸、维生素、小肽和核苷酸等56种代谢成分在肠道组织和内容物间发生了交换,对肠炎的发生发展可能有重要的作用。结果表明,20%-40%SBM损伤了珍珠龙胆的肠道黏膜屏障并导致了肠炎的发生,肠道菌群的改变以及肠道中与免疫等相关信号通路的激活和营养吸收代谢通路的普遍抑制与肠炎的发生有密切的关系。2.大豆浓缩蛋白对珍珠龙胆石斑鱼肠道黏膜屏障损伤的机制研究720尾石斑鱼随机分为3组（n=4）:鱼粉对照组（FM）、20%SPC组（SPC20）和40%SPC组（SPC40）,配制3种等氮（50%粗蛋白）等脂（10%粗脂肪）饲料饲喂10周。结果发现:与FM组相比,（1）实验组WGR和SGR随SPC替代水平增加依次显着降低;（2）半定量分析显示,SPC40组肠道炎症表征非常明显,而SPC20组较轻;后肠水通道基因Aqu1,Aqu4,Aqu8,Aqu9,Aqu11和Aqu12的表达水平随替代水平的升高呈显着下降趋势（P<0.05）,而Aqu10和紧密连接蛋白jam,claudin3和ZO-1基因表达水平在SPC40组显着升高,claudin12,claudin15和离子转运载体Guanylin,nkaα-1和clc基因表达水平在SPC40组显着降低。（3）后肠Trypsin酶活性随SPC替代水平增加呈显着上升趋势;（4）后肠抗氧化酶活性（T-SOD、GR和GPx）随SPC替代水平升高呈显着上升趋势;后肠促炎性基因IL1β、IL8、IL12、IL17和TNFα的表达水平在SPC40组呈显着升高趋势（P<0.05）,反之,抗炎性基因IL4,IL5,IL10,TGFβ1基因表达水平在SPC40组呈显着下降趋势;（5）16S高通量测序显示,在门水平上,相对丰度前10的物种分别为Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes,Actinobacteria和Cyanobacteria等。Proteobacteria丰度在SPC40组显着下降,而Firmicutes,Bacteroidetes和Actinobacteria丰度在SPC40组显着升高。在属水平上,相对丰度前10的物种分别为Photobacterium,Faecalibacterium,Vibrio,Bacteroides和双歧杆菌属（Bifidobacterium）等。Photobacterium在实验组丰度依次显着降低,其余物种丰度在SPC40组显着升高;（6）转录组比较分析发现,SBM40和SPC40两组间只有17.2%（936/5445）差异基因有类似表达模式。KEGG富集发现,在显着富集到的与免疫疾病/系统、感染病和信号转导有关的代谢通路中,SBM40和SPC40共有差异基因富集到的占30.55%（11/36）,SBM40组特有差异基因富集到的占43.55%（27/62）,SPC40组特有差异基因富集到的仅占5.13%（2/39）,而SPC40特有差异基因富集到的与营养物质消化吸收相关的占69.23%（27/39）。SPC40和SBM40均引起了产生Ig A的肠道免疫网络通路中Ig A的反常升高。结果表明,40%SPC对珍珠龙胆肠道稳态影响更加显着,并诱导了珍珠龙胆肠炎产生肠炎。与SBM诱导的肠炎相比,40%SPC诱导的肠炎可能是营养代谢失衡下引起的肠道免疫功能的紊乱所致。3.发酵豆粕对珍珠龙胆石斑鱼肠道粘膜屏障损伤的机制研究720尾石斑鱼随机分为3组（n=4）:鱼粉对照组（FM）、20%FSBM组（FSBM20）和40%FSBM组（FSBM40）,配制3种等氮（50%粗蛋白）等脂（10%粗脂肪）饲料饲喂10周。结果发现:与FM组相比,（1）实验组WGR和SGR随FSBM替代水平增加依次显着降低;（2）半定量分析显示,FSBM40组肠道炎症表征非常严重,FSBM20组次之;后肠水通道基因Aqu1,Aqu4和Aqu12及紧密连接蛋白jam,claudin3,claudin12,claudin15和ZO-3的表达水平显着下降,而Aqu8,Aqu9,Aqu10和ZO-1基因表达水平显着升高;离子转运载体nkcc和clc基因表达水平呈显着降低趋势;（3）后肠Trypsin酶活性随FSBM替代水平增加呈显着上升趋势;（4）后肠抗氧化酶活性（T-SOD、GR和GPx）随FSBM替代水平升高呈显着上升趋势;后肠促炎性基因IL1β,IL8,IL12,IL17,IL32,TNFα和CSF1的表达水平呈显着增加趋势,反之,抗炎性基因IL4,IL5,IL10,TGFβ1表达水平呈显着下降趋势;（5）16S高通量测序显示,在门水平上,相对丰度前10的物种分别为Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes,酸杆菌门（Acidobacteria）和Actinobacteria等。Proteobacteria丰度在FSBM40组显着下降,Bacteroidetes,Firmicutes,Acidobacteria和Actinobacteria丰度在FSBM40组显着升高。在属水平上,相对丰度前10的物种分别为Photobacterium,Stenotrophomonas,Vibrio,叶杆菌属（Phyllobacterium）和色盐杆菌属（Chromohalobacter）等。Photobacterium在FSBM40组丰度显着降低,其余各物种丰度总体显着升高;（6）转录组比较分析发现,SBM40和FSBM40两组间只有18.98%（920/5445）差异基因有类似表达模式。KEGG富集发现,在显着富集到的与免疫疾病/系统、感染病和信号转导有关的代谢通路中,SBM40和FSBM40共有差异基因富集到的占42.59%（23/54）,SBM40组特有差异基因富集到的占47.17%（25/53）,FSBM40组特有差异基因富集到的占42.11%（24/57）。分析发现,TLR-My D88-NF-κB信号通路在FSBM诱导的珍珠龙胆肠炎中发挥了重要作用。结果表明,20%-40%FSBM替代鱼粉影响了珍珠龙胆的肠道稳态,与SBM诱导的珍珠龙胆肠炎类似,肠道中与免疫等有关信号通路的普遍激活,对肠炎发生产生了重要影响。4.不同大豆蛋白源对珍珠龙胆石斑鱼肠道黏膜屏障损伤机制研究比较三种大豆蛋白源在40%替代水平下,均引起了珍珠龙胆石斑鱼明显的后肠炎症表征,本部分对该替代水平下三种大豆蛋白饲喂的珍珠龙胆的生长生理等进行比较分析。结果发现:与FM组相比,（1）WGR和SGR在各实验组中均显着降低,各实验组间无显着性差异,但SPC40组略高于SBM40组和FSBM40组;（2）半定量分析显示,SBM40与FSBM40组肠道炎症表征均非常严重,程度相当,而SPC40组肠炎严重程度显着轻于SBM40和FSBM40,但肠道炎症表征非常明显;后肠水通道基因Aqu1,Aqu4,Aqu8,Aqu9,Aqu10,Aqu11,Aqu12及紧密连接蛋白基因jam,occludin,claudin3,claudin12,claudin15,ZO-1和ZO-3和离子转运载体基因nkcc,guanylin,nkaα-1,clc的表达水平均受到了不同程度的显着性影响;（3）后肠Trypsin酶活性在各实验组中均显着升高,且在SPC40组显着高于其他两实验组;（4）后肠抗氧化酶活性（T-SOD、GR和GPx）在各替代组呈显着上升趋势,且在SPC40组中活性最高;后肠促炎性基因中,除IL32和CSF1基因表达水平在SPC40组无显着差异外,IL1β、IL8、IL12、IL17、IL32、TNFα和CSF1基因表达水平在各实验组中均呈显着升高趋势,反之,抗炎性基因IL4,IL5,IL10,TGFβ1表达水平在各实验组中均显着下降;（5）16S高通量测序显示,在门水平上,相对丰度前10的物种分别为Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes,Acidobacteria,Actinobacteria和Cyanobacteria（蓝藻细菌门）等。Proteobacteria在各实验组中丰度均显着下降,其中FSBM40组丰度显着高于SBM40和SPC40组。Firmicutes,Bacteroidetes和Actinobacteria丰度在各实验组均显着升高,Acidobacteria丰度在SBM40组和SPC40组无显着变化,在FSBM40组显着升高。在属水平上,总体上相对丰度前10的物种分别为Photobacterium,Stenotrophomonas,Vibrio,Phyllobacterium,Neisseria和Bacteroides等。Photobacterium在各实验组中丰度均显着降低。Phyllobacterium和Neisseria丰度在SPC40组无显着差异,unidentified＿Rikenellaceae丰度在SPC40和FSBM40组无显着差异。其余各物种丰度在各实验组中均显着升高（P<0.05）,在各实验组间具有一定的差异性;（6）转录组比较分析发现,SBM40、SPC40和FSBM40三组间只有7.80%（554/7101）差异基因有类似表达模式。KEGG富集发现,在显着富集到的与免疫疾病/系统、感染病和信号转导有关的代谢通路中,SBM40、SPC40和FSBM40共有差异基因富集到的占30%（9/30）,SBM40组特有差异基因富集到的占45.10%（23/51）,FSBM40组特有差异基因富集到的占60.53%（23/38）,SPC40组特有差异基因富集到的占2.86%（1/35）;而SPC40中,与营养物质吸收代谢相关通路显着富集到的占67.44%。分析发现,TLR-My D88-NF-κB信号通路在SBM40和FSBM40诱导的珍珠龙胆肠炎中发挥了重要作用。结果表明,40%替代水平的SBM、SPC和FSBM均引起了珍珠龙胆肠道黏膜屏障损伤并导致了肠炎的发生;SBM和FSBM诱导的珍珠龙胆肠炎通路变化有一定的保守性;SPC诱导的肠炎可能营养代谢失衡下引起的肠道免疫功能的紊乱所致。
翟星辰[5]（2019）在《壳寡糖免疫增强及对肾癌抑制作用的研究》文中研究表明肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,发病率呈逐年上升趋势。传统的放化疗虽然可以杀伤大部分癌细胞,但对自身免疫系统也伤害较大,体质虚弱的患者可能会因此而免疫力更加低下,反而会加速癌细胞扩散。因此,在抗肾癌药物研究过程中,急需开发具有一定抗肿瘤功能、可以提高机体免疫力,从而提高病患生存质量的新型药物。作为自然界唯一带正电荷的碱性氨基低聚糖,壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤、免疫增强等优良的生物活性,近年来受到广泛关注。本课题以水溶性壳寡糖（Chitosan oligosaccharide,COS）为研究对象,系统评价COS的免疫增强作用、对肾癌的抑制作用及机制。利用三种免疫模型系统研究COS体内外免疫增强作用及机制。以转录组测序结果为线索,发现COS可以增强巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性,提高NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的水平。在环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型中,COS显着恢复小鼠降低的单核吞噬指数（P<0.01）,提高脾细胞中T淋巴细胞增殖转化能力（P<0.05）和NK细胞活力（P<0.05）,表明COS能有效缓解环磷酰胺引起的免疫抑制状态;在60Co-γ诱导的放射损伤小鼠模型中,COS显着提高脾指数（P<0.05）、T淋巴细胞亚群中CD4+/CD8+比例（P<0.05）,延长放射损伤小鼠生存期;在S180皮下移植瘤残瘤模型中,COS显着提高脾指数（P<0.05）,增强脾细胞中T淋巴细胞活化和NK细胞活力（P<0.05）,促进血浆中TNF-α的表达,在COS与环磷酰胺联合使用后,对皮下移植瘤的抑制效果更显着（P<0.01）,高达74.5%和89.3%。基于COS的抗肿瘤功能,结合其生物分布特性,展开COS对肾原位癌的抑制作用研究。通过合成近红外荧光染料Cy7标记的COS（COS-Cy7）,利用活体成像技术,探明COS主要分布在肾脏。通过构建人源肾癌裸鼠肾原位移植瘤模型,证实COS可以剂量依赖地抑制肾原位移植瘤的生长,高剂量（40 mg/kg）抑制率可达55.8%,免疫组化和免疫荧光染色结果表明,COS能够促进肿瘤细胞内ROS积累,诱导细胞凋亡。COS可以作为免疫增强剂,辅助肾原位癌的放疗,促进Caspase-3活化,为放疗增敏;COS联合等剂量化疗药物可以起到化疗增效作用,在抗肾癌效果相同的情况下,能够降低化疗药物5-Fu的用量（从30 mg/kg降低到15 mg/kg）,发挥同效减毒的作用。通过分子生物学手段,结合信号通路分析,揭示COS抑制肾癌的作用机制。COS能够剂量依赖地抑制肾癌细胞生长,使肾癌细胞发生G2/M期阻滞,损伤DNA,诱导凋亡。通过转录组测序技术,筛选COS作用肾癌细胞产生的差异基因,富集分析后发现COS主要参与代谢通路、PI3K-Akt和NF-κB信号通路等,COS打破了肾癌细胞的氧化还原平衡,细胞启动内源性抗氧化防御机制。COS通过激活GRP78-PERK-e IF2α-ATF4-CHOP通路,诱导肾癌细胞发生内质网应激反应,促进线粒体释放Cyt c,降低线粒体膜电位,刺激肿瘤细胞内ROS积累,进而诱导肾癌细胞凋亡。COS对肾癌的抑制涉及多条信号通路,内质网氧化应激、内源性凋亡、免疫增强等,共同发挥拮抗肾癌的作用。
余新刚[6]（2019）在《miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究》文中认为黄牛和水牛是日本血吸虫（Schistosoma japonicum）的重要天然宿主,也是我国血吸虫病的主要传染源。它们对日本血吸虫感染呈现不同的适宜性,进而导致血吸虫在宿主体内的生长发育、存活以及对宿主的致病作用呈现较大差异。为了探究miRNAs在血吸虫生长发育以及与宿主相互作用过程中的调节作用,本研究采用高通量测序技术（Illumina的Hiseq Xten测序）对来自黄牛（适宜性宿主）和水牛（非适宜性宿主）的日本血吸虫成虫以及感染前（T1）、感染后14 d（T2,早期感染）和感染后42 d（T3,急性感染）黄牛和水牛的血浆、外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）的miRNA进行测序,比较黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的差别以及黄牛和水牛血浆和PBMC在感染前后miRNA表达谱的变化,并对日本血吸虫真核翻译起始因子（eukaryotic initiation factor 4,eIF4A）的生物学功能进行初探。上述研究可为抗血吸虫疫苗候选分子和新药靶标的筛选提供新的思路。1.黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛来源的日本血吸虫成虫miRNA的表达谱,分别获得了6378万和6321万条miRNA序列。通过生物信息学分析鉴定了206个miRNAs,包括79个已注释的日本血吸虫miRNAs、127个与其他物种miRNAs高度相似的新miRNAs。其中,5个已注释的miRNAs（sja-miR-124-3p、sja-miR-219-5p、sja-miR-2e-3p、sja-miR-7-3p和sja-miR-3490）在水牛组虫体中呈现显着性上调表达,10个新的miRNAs在两组虫体中呈现差异表达。sja-miR-124-3p在黄牛和水牛源虫体中的表达趋势与啮齿类宿主来源虫体一致,可参与调节日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A等的表达。双荧光素酶报告试验证实sja-miR-219-5p可与靶基因Hsc20特异序列结合。5个已注释的差异表达miRNAs可能参与268个靶基因的生物学功能调节,包括虫体的咽肌发育、嘌呤代谢、减数分裂的胞质分裂、减数分裂中纺锤体的定位、细胞骨架依赖性细胞内运输、r RNA加工、m RNA运输、蛋白质运输和繁殖等过程。其中,sja-miR-124-3p和sja-miR-219-5p可能通过调控虫体的神经系统发育、应激反应等进而影响虫体在两宿主体内的生存及发育。2.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛在血吸虫感染不同时期血浆中miRNA的表达谱。测序后共获得352,727,942条有效序列,平均每个样本有14,696,997条。黄牛和水牛组血浆miRNA的基因组比对率分别为90.80%和99.60%。黄牛和水牛血浆在血吸虫感染各期已注释的miRNAs有1,030个,新发现的miRNAs分别为444和438个。与感染前相比,黄牛和水牛血浆在感染早期分别有3个和9个miRNAs呈现特异性差异表达;在急性感染期黄牛和水牛血浆有9个miRNAs呈现共性差异表达,黄牛和水牛血浆分别有39和23个miRNAs呈现特异性差异表达。与感染早期相比,在急性感染期黄牛与水牛血浆有4个miRNAs呈现共性差异表达,分别有35和5个miRNAs呈现特异性差异表达。GO分类和KEGG分析发现这些差异表达miRNAs的靶基因与多个信号通路有关。在感染早期,黄牛和水牛血浆miRNAs在脂肪酸代谢和胰岛素信号通路调节中存在很大差异,可能影响虫体在两宿主体内的生存及发育。3.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛PBMC在血吸虫感染不同时期miRNA的表达谱。测序后共获得228,483,170条序列,平均每个样本有9,520,132条有效序列。在血吸虫感染各时期黄牛和水牛PBMC中已注释的miRNAs有1,030个,新发现的miRNAs分别为234和228个。与感染前相比,黄牛与水牛PBMC之间在T3/T1期有45个miRNAs呈现共性差异表达,另有111和69个miRNAs呈现特异性差异表达。与感染早期相比,黄牛和水牛PBMC在T3/T2期有64个呈现共性差异表达,另有147和36个miRNAs呈现特异性差异表达。GO分类和KEGG分析发现这些差异表达miRNAs的靶基因与多个信号通路有关。在急性感染期,黄牛和水牛PBMC的miRNAs在Th1/Th2型细胞因子、Toll样受体信号通路等方面存在差异,可能影响宿主的免疫应答。4.日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析。根据Gen Bank中日本血吸虫eIF4A的基因序列（FN315265.1）设计引物,扩增Sj-eIF4A基因;构建其重组表达质粒并转化感受态细胞。采用IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白。采用q RT-PCR法检测Sj-eIF4A在不同发育阶段以及不同适宜性宿主来源虫体的转录水平。在体内外对21 d童虫中该基因进行RNA干扰实验,通过扫描电镜观察RNA干扰对虫体繁殖和结构的影响。结果显示,Sj-eIF4A基因全长为1179 bp,编码392个氨基酸,融合蛋白Mr约为46 k Da。Sj-eIF4A在被检的日本血吸虫不同发育阶段均有表达,尤其在毛蚴、14 d童虫以及42 d雌虫体内转录水平较高;在适宜性宿主黄牛和BALB/c小鼠来源虫体内的转录水平高于非适宜性宿主水牛和Wistar大鼠。Sj-eIF4A特异性si RNA不仅能够有效抑制虫体Sj-eIF4A的转录水平并诱导小鼠产生20.63%的减虫率和31.21%的肝脏减卵率,而且能够引起雌虫的排卵异常以及虫体腹吸盘和雌雄虫部分体表结构发生改变。综上所述,本文对黄/牛来源日本血吸虫miRNA的表达差异及黄牛和水牛感染前后PBMC和血浆miRNA表达差异进行了比较分析,并对日本血吸虫真核翻译起始因子Sj-eIF4A进行了克隆表达和基因特性分析。发现了一些对血吸虫生长发育和宿主免疫应答至关重要的虫源性和宿主源性miRNA分子,初步探明了Sj-eIF4A在日本血吸虫生长发育中的重要作用,为揭示不同适宜性宿主与日本血吸虫间的相互作用提供了有价值的信息,也为寻找抗日本血吸虫有效的疫苗候选分子或新药靶标提供了新思路。
郑锦滨[7]（2019）在《日本囊对虾高温胁迫响应机制研究》文中研究指明日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus Bate,1888）是我国重要的对虾养殖品种之一,具有重要的经济价值。日本囊对虾耐高温能力差、度夏死亡率高、养殖适温季节较短和养殖适温海域较窄等问题限制了日本囊对虾养殖面积的拓展和养殖总产量的增加,成为限制其产业发展的重要因素。全面了解日本囊对虾高温胁迫应答机制,一方面有利于拓展和深化对水生动物高温胁迫响应机制的认识,另一方面有助于指导制定有效的养殖管理策略以提高高温季节日本囊对虾的养殖成活率。然而,目前有关日本囊对虾响应高温胁迫的研究鲜有报道,其高温胁迫响应机制、度夏死亡率高的机理尚不明确。本研究通过日本囊对虾高温胁迫不同阶段的转录组和microRNA（miRNA）表达谱的分析,并结合热休克应答和抗氧化应答相关基因的发掘和功能分析,以及酶学和组织学等研究,聚焦高温胁迫下日本囊对虾热休克应答、抗氧化应答、免疫应答、物质和能量代谢相关基因的表达模式以及氧化损伤和组织病理变化,探索了日本囊对虾对高温胁迫的应答机制和度夏死亡率较高的潜在机理。主要研究结果如下:1.日本囊对虾响应高温胁迫的转录组学研究通过比较转录组学分析了日本囊对虾在高温胁迫不同阶段肝胰腺和鳃组织基因表达模式变化。构建了日本囊对虾响应高温胁迫的差异基因表达谱,共获得95,763条unigene。高温胁迫3 h时,在肝胰腺和鳃组织中分别鉴定到301和1136个DEGs;高温胁迫96 h时,在肝胰腺和鳃组织中分别鉴定到443和1228个DEGs,并开展了数据深度挖掘和验证。首先,基于DEGs功能的表达谱变化分析表明,高温胁迫下日本囊对虾肝胰腺或鳃组织中多种热休克蛋白和抗氧化酶基因表达量呈上调趋势;相反,日本囊对虾肝胰腺或鳃组织中甲壳素、α-2巨球蛋白同系物、抗脂多糖因子、酚氧化酶原激活因子、酚氧化酶原b、C型凝集素和细胞粘附蛋白等诸多免疫相关基因表达量在高温胁迫期间持续下调。其次,基于KEGG通路的表达谱变化结果表明,高温胁迫导致日本囊对虾肝胰腺糖代谢通路中的关键限速酶基因,包括磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶、α-葡萄糖苷酶、糖原磷酸化酶等表达量显着降低;鳃组织中两大重要的产能代谢通路,即三羧酸循环和呼吸链氧化磷酸化通路中一些关键酶基因,如柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素c以及ATP合酶等表达量降低,预示着高温胁迫下日本囊对虾产能代谢受到抑制。推测高温胁迫导致的对虾免疫能力下降以及能源物质代谢和产能代谢受抑制是日本囊对虾度夏死亡率高的主要潜在原因。2.日本囊对虾高温胁迫下的microRNA表达谱分析除构建了差异基因表达谱外,论文还对高温胁迫下日本囊对虾肝胰腺和鳃组织中的miRNA表达谱进行了分析,共鉴定到26个已知的miRNA和53个新预测的miRNA,成熟miRNA长度主要集中在21～23 nts。筛选RPM>100的miRNA进行差异表达和功能分析,共获得15个高温胁迫下差异表达的miRNA。以日本囊对虾转录组为参考,对差异表达miRNA的靶基因进行预测和功能注释,结果表明,在高温胁迫下,对虾miRNA可以通过调控细胞信号转导、抗应激响应、核糖体合成、转录、RNA加工、脂质代谢等诸多生物学过程参与机体对高温胁迫的响应。本研究还以WSSV基因组为参考进行对虾miRNA的靶基因预测,鉴定到30个具有潜在抗WSSV功能的对虾miRNA。3.高温胁迫下日本囊对虾的抗氧化应答和组织病理变化基于差异基因表达谱,重点筛选了日本囊对虾的抗氧化酶基因,进行了基因克隆和不同温度胁迫下的表达分析,并结合高温胁迫下机体的抗氧化酶活性变化和组织病理变化研究,阐述了日本囊对虾高温胁迫下的抗氧化应答和组织损伤。克隆了日本囊对虾谷胱甘肽过氧化物酶（MjSeGpx）和谷胱甘肽硫转移酶（MjGSTMu）基因的全长cDNA序列,二者编码的氨基酸序列分别具有Se-Gpx和GSTMu家族典型的结构和功能域。MjSeGpx和MjGSTMu基因表达的组织分布表明,MjSeGpx和MjGSTMu在肝胰腺、鳃、血细胞、胃、肠道、心脏、肌肉和眼柄中均有表达,其中MjSeGpx在血细胞和肝胰腺中表达较高,MjGSTMu在肝胰腺中表达最高。高温胁迫下,肝胰腺和鳃组织中MjSeGpx和MjGSTMu基因表达量整体呈现先升高后降低的变化趋势。在32℃和34℃胁迫下,肝胰腺中MjSeGpx和MjGSTMu基因表达水平均在12 h达到峰值,鳃组织中MjSeGpx和MjGSTMu基因表达水平分别于72 h和48 h达到峰值。同时,在32℃和34℃胁迫下,日本囊对虾肝胰腺和鳃组织中CAT活性均显着增大,活性增大的速度和峰值均与温度呈正相关趋势。此外,在34℃胁迫24 h时,日本囊对虾肝胰腺中MDA含量显着升高2.30倍,鳃组织中MDA含量在32℃和34℃胁迫6 h时虽有所升高,但仍维持在较低水平。对高温胁迫下日本囊对虾肝胰腺的组织病理变化观察发现,32℃和34℃胁迫24 h和48 h时,对虾肝胰腺出现肝小管肿胀、管腔畸形、相邻肝小管挤压、肝小管边界模糊等组织病理变化,胁迫温度越高、胁迫时间越长,症状越严重。4.日本囊对虾热休克蛋白和热休克因子基因的表达及功能研究热休克蛋白和热休克因子是一类最具代表性的高温胁迫响应因子。克隆了日本囊对虾热休克蛋白10（MjHSP10）和热休克因子（MjHSF1）基因的全长cDNA序列,并探讨了 MjHSP10和MjHSF1在机体热休克应答过程中发挥的重要作用。推测的MjHSP10和MjHSF1氨基酸序列具备HSP10和HSF1家族的特征结构与功能序列。MjHSP10和MjHSF1基因表达的组织分布表明,MjHSP10和MjHSF1在日本囊对虾的肝胰腺、鳃、血细胞、胃、肠道、心脏、肌肉和眼柄等8个组织中均有表达。高温胁迫能显着诱导日本囊对虾肝胰腺和鳃组织中MjHSP1O、MjHSF1、MjHSP60、MjHSP70和MjHSP90基因表达量的增加,表达量上调水平与胁迫温度呈现正相关趋势。4种HSPs对高温胁迫的响应存在差异,MjHSP10、MjHSP60和MjHSP90基因的表达量在整个高温胁迫期间或大多数时间点均保持上调状态,而MjHSP70的表达量仅在少数时间点上调,且上调水平低于其他3种HSPs。此外,高温胁迫下MjHSF1表达水平的上调幅度较低,肝胰腺中MjHSF1仅在较长时间（48 h）胁迫下表达水平上调,鳃组织中MjHSF1仅在较高温度（34℃）胁迫下表达量增加。使用RNAi技术对MjHSF1进行沉默,注射dsMjHSF1 24 h和48 h后可显着抑制血细胞中MjHSF1基因的表达量,注射dsMjHSF1 48 h后,血细胞中MjHSP10基因表达量也显着降低,表明MjHSF1对MjHSP10的表达具有调控作用。GST pull-down研究表明,MjHSP10与MjHSF1的DNA结合域存在相互作用,从而可能抑制MjHSF1的DNA结合活性。
徐东坡[8]（2018）在《基于转录组学和代谢组学研究三丁基氯化锡对暗纹东方鲀幼鱼的毒理学机制》文中指出暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）俗称河鲀,属硬骨鱼纲（Osteichthyes）鲀形目（Tetraodontiformes）鲀科（Tetraodontidae）东方鲀属（Takifugu）,是长江中下游流域的一种传统名贵鱼类,具有溯河洄游习性,在我国主要分布于渤海、黄海、东海及长江中下游。三丁基氯化锡（tributyltinchloride,TBT-Cl）是一类毒性最大、应用最广的有机锡化合物,当前在海淡水环境中仍有较高残留,且在自然环境变化或人类扰动下具有较高的再暴露风险。已有研究表明,TBT-Cl暴露会对水生动物产生免疫毒性、生殖毒性、神经毒性、生长和发育障碍等多种毒性影响,对水生动物的生活史过程威胁巨大。然而,目前有关TBT-Cl对鱼类的毒理效应的机制研究却较为薄弱,尤其是TBT-Cl对在海水、淡水及河口区均有分布的洄游性鱼类的毒性效应及机制均未见报道。为此,本研究以暗纹东方鲀幼鱼为研究对象,开展TBT-Cl暴露的急性毒理实验,并利用两种组学方法从转录组水平和代谢物水平探讨暗纹东方鲀对TBT-Cl暴露的毒理学响应机制,以期为TBT-Cl的水生态安全性评价提供支撑,并为重要洄游通道、产卵场等关键水域的TBT-Cl残留限量标准制（修）订提供基础性资料,同时也为探明TBT-Cl暴露对水生生物毒性作用的机理提供新的思路和研究方法。首先,采用半静水式接触实验法开展了 TBT-Cl对暗纹东方鲀幼鱼（平均体长:10±1.5 cm;平均体重:25±1 g）的急性毒理学研究。结果显示,TBT-Cl对暗纹东方鲀幼鱼的24h、48h和96h的半致死浓度LC50分别为61.02μg·L-1、40.66μg.L-1和19.62μg·L-1,同时根据经验公式得出TBT-Cl对暗纹东方鲀幼鱼的安全浓度为1.962μg·L-1。本研究表明,TBT-Cl属于剧毒化学物质,水域环境中TBT-Cl的存在或浓度增加对暗纹东方鲀乃至所有渔业资源都会产生严重的威胁。该研究结果为之后亚急性毒理研究实验中TBT-Cl浓度的设置提供了科学依据,也可为TBT-Cl其他鱼类的毒理学研究提供参考资料。其次,为查明暗纹东方鲀幼鱼对TBT-Cl亚急性暴露的响应的分子机制,本研究设置10%、20%和50%96 h-LC50TBT-Cl三个浓度的处理组和对照组的暴露实验,96h时摘取实验鱼的肝脏用于转录组学比较分析。结果显示,各处理组和对照组的肝脏转录组相比共筛选出4,028个差异表达基因,其中上调基因主要为免疫应答相关基因,下调基因主要为蛋白合成和糖类与脂质代谢相关基因。差异表达基因通过KEGG主要富集到109个通路,在GO数据库中富集1,218个类别,这些基因主要参与信号转导、免疫应答、细胞自噬和粘附作用等,其中相关信号通路有MAPK信号通路、JAK/STAT信号通路、Wnt及Toll样受体信号通路等。本研究首次进行了暗纹东方鲀应答TBT-Cl暴露的比较转录组学研究,为深入探索暗纹东方鲀的相关功能基因和通路的毒理学响应机制奠定了坚实的基础。在差异基因筛选分析中,发现4个上调基因和2个下调基因在TBT-Cl暴露过程中可能发挥着重要的作用,通过qRT-PCR实验发现,这6个基因的时空表达模式具有一定的差异。其中,UBE3D在急性和慢性处理鳃中被TBT-Cl显着诱导,最大诱导值分别出现在B组和20 d,分别为对照组的6.18和3.17倍;在肝脏中被显着抑制,最小抑制值分别出现在C组和30 d,为对照组的0.10和0.03倍。STARD3在急性和慢性实验鳃中都被显着诱导,最大值分别为B组相对于对照组的19.38倍和20 d的4.03倍。该基因在A组的肝脏中也被显着诱导,最大值为对照组的6.96倍。RBBP5在急性实验的肝脏和鳃中都被显着诱导,分别出现在A组和B组,其最大值分别为对照组的11.60和6.18倍。在慢性应激的鳃中也被显着诱导,出现在20 d,最大值为对照组的10.50倍。CCNE1在急性暴露的肝和鳃中、慢性暴露的鳃中都被显着诱导,其分别出现在B组、C组和20 d,最大值分别为对照组的8.77、14.64和12.87倍。ANGPTL2b在急性和慢性实验的鳃中都被显着诱导,分别为C组和20 d,最大值分别为对照组的23.55和9.36倍。Prdx6在急性实验的鳃中被显着抑制,而在慢性实验肝脏中被显着诱导,分别出现在C组和20 d,其最小值和最大值分别为对照组的0.12和3.26倍。本研究表明,这些差异基因可能通过激活免疫系统、启动免疫信号应答、参与免疫损伤的修复通路、加速适应性炎症和维持体内组织环境稳态等途径参与暗纹东方鲀对TBT-C1的暴露应激,但其具体生物学机制还需进一步研究。再次,为深入探讨暗纹东方鲀幼鱼对TBT-C1的响应机制,本研究基于转录组文库的差异基因中鉴定出了可能参与免疫应答、结构上高度保守的分子伴侣—HSP90β1基因,通过RACE技术成功克隆了HSP90β1基因全长为2,775 bp,包含2,412 bp开放阅读框,编码803个氨基酸。利用Mega5构建了 NJ系统进化树,并进行了亲缘关系分析。利用定量实时PCR（qRT-PCR）检测该基因在各个组织表达情况,随后设计TBT-Cl的急性和慢性实验,通过qRT-PCR、组织化学和免疫组化检测HSP90β1 mRNA水平及暗纹东方鲀的损伤状况。结果显示,HSP90β1mRNA转录本广泛表达于脑、肝脏、鳃、心脏、肌肉、肾、脾、血细胞、胃和肠等组织中,而在肝脏和鳃中的表达水平较高。急性实验三个处理组中,鳃组织中的HSP90β1表达量分别是对照组的5.67、4.97和8.77倍;在肝脏组织中分别为0.70、1.01和2.55倍。在慢性实验中,鳃组织中第10d、20d和30d时HSP906β1表达量分别为对照组的6.11、18.21和2.63倍,肝脏中分别是0.13、0.60和0.12倍;恢复实验第15d和第30d鳃中分别是1.52和1.11倍,肝脏中分别是0.70和1.00倍。肝脏和鳃在不同浓度TBT-Cl下损伤程度不同,TBT-Cl胁迫后的HSP90β1蛋白在胞质中表达量显着上升,并参与了免疫应激过程的胞质重组。本研究表明鳃的HSP90β1表达水平高于肝脏,各组HSP90β1 mRNA的表达量随着慢性毒理实验和恢复实验的进行表达模式有一定的差异。肝脏和鳃作为暗纹东方鲀防御体系的重要组织,对TBT-Cl的毒性影响做出了免疫应答。HSP90β1可能参与了暗纹东方鲀抗TBT-Cl的侵袭以维持自身免疫稳态。研究结果将有助于深入了解暗纹东方鲀HSP90β1在对抗TBT-Cl毒性作用过程中的特异作用,并有望阐明其在免疫毒理过程的可能机制。最后,为在代谢物水平上探究暗纹东方鲀幼鱼对TBT-Cl急性暴露的响应,本研究利用LC-MS技术对暗纹东方鲀三个急性处理组和对照组的血清和肝脏样本进行了测试,并进行代谢组学比较分析。结果显示:血清代谢组在正、负离子模式下分别筛选出87个和34个差异代谢物,归属于磷酸甘油酯类、不饱和脂肪酸、氨基酸等,主要与鞘脂代谢、磷酸甘油酯代谢和不饱和脂肪酸的生物合成等代谢通路有关。肝脏代谢组在正、负离子模式下分别筛选出92个和71个差异代谢物,归属于磷酸甘油酯类、不饱和脂肪酸、氨基酸等,主要与磷酸甘油酯代谢、花生四烯酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成等代谢通路有关。进一步分析显示,三个处理组暗纹东方鲀肝脏中的参与磷酸甘油酯代谢的磷脂类（16种PC类、13种PE类、1种PS类等）在正、负模式下检测到的相对含量均比对照组显着上升（P<0.01）,上调最高的是50%96h-LC50 处理组在负模式下测得的PC（15:0/22:6（4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z））,相比对照组上调4,263.90倍;上调最低的是20%96h-LC50处理组的LysoPC（18:2（9Z,12Z））,相比对照组上调1.58倍。在10%、20%和50%96h-LC50处理组中,肝脏中前列腺素E2分别比对照组上调6.67、6.93和7.86倍,花生四烯酸分别比对照组下调15.93、22.50和16.07倍;血清中乙酰胆碱分别比对照组下调2.84、2.30和2.63倍,鞘氨醇分别下降1.39、1.89和2.07倍,鞘磷脂分别上升2.69、2.42和2.49倍。本研究表明,TBT-Cl暴露后,暗纹东方鲀体内PC类至乙酰胆碱的途径、合成鞘氨醇的途径被抑制,肝脏受损后体内ARA代谢、其他不饱和脂肪酸合成等途径被激活,体内磷酸甘油酯类在细胞膜内外运转物质的过程被加速,随着代谢物中溶血卵磷脂和前列腺素E的浓度上升,解毒功能增加,炎症反应降低。该代谢响应机制可能是其暗纹东方鲀幼鱼对TBT-Cl的耐受程度高于其他鱼类的重要原因之一。本研究,为理解暗纹东方鲀在TBT-Cl胁迫下体内代谢途径受干扰的具体情况以及分析代谢物含量变化、相关基因变化和生物表型变化之间的关联提供了可能,为TBT-Cl暴露对暗纹东方鲀的毒性机制提供了新的理论指导。
霍欢欢[9]（2017）在《拥挤胁迫对大菱鲆接种迟钝爱德华氏菌减毒活疫苗免疫应答的影响》文中指出高密度养殖是集约化养殖模式的主要特点,在鱼类养殖生产过程中,过高的养殖密度可对鱼类造成拥挤胁迫。长期的拥挤胁迫不仅增大鱼类遭受机械损伤的机率,还会显着影响鱼类神经内分泌水平,从而进一步影响鱼类正常的血液理化指标、抗氧化及应激水平、代谢水平以及免疫水平等,最终可能导致鱼类生长减缓,抵御病害能力下降,甚至发生病害和死亡。可见,由高密度养殖造成的慢性拥挤胁迫已成为影响集约化养殖条件下鱼类健康和福利水平的重要因素。大菱鲆（Scophthalmus maximus）是原产欧洲沿海的名贵经济鱼类,生长速度快、品质优良,是适宜集约化养殖的优选品种,现今已成为我国北方沿海工厂化养殖业的主导品种之一。近年来,随着大菱鲆养殖规模的快速扩大以及养殖环境的不断恶化,病害时有发生。迟钝爱德华氏菌病（Edwardsiellosis）是大菱鲆多发疾病,迟缓爱德华氏菌是该病致病菌,常规化学药品不仅难以稳定有效的防治此类病害,还可能会导致食品安全问题的发生。接种疫苗是预防疾病爆发的有效手段之一。减毒迟钝爱德华氏菌活疫苗已在大菱鲆上被证实具有显着免疫保护效果,但不同免疫策略会直接影响疫苗的免疫效力。大菱鲆的主要养殖模式是工厂化,养殖密度相对较高,由此而来的拥挤效应对鱼类而言是一种长期的慢性胁迫。为保证疫苗接种的安全有效性,需要对大菱鲆在拥挤胁迫条件下的疫苗接种效果进行科学的评估;拥挤胁迫对大菱鲆接种迟钝爱德华氏菌减毒活疫苗免疫应答的影响及其机制研究亟待展开。本研究将大菱鲆放养于高、中、低三个密度组（HD,MD,LD）,经接种减毒迟钝爱德华氏菌活疫苗后,利用酶联免疫、流式细胞仪术、现代分子生物学等技术手段,监测大菱鲆免疫相关因子的变化,基因的表达规律,阳性B细胞的动力学特征,并通过构建关键免疫器官比较转录组,分析拥挤胁迫对大菱鲆免疫应答的影响。主要研究结果和内容如下:1拥挤胁迫对大菱鲆血液生理参数及免疫基因表达的影响通过监测不同养殖密度组（LD:5kg/m2,MD:10kg/m2,HD:20kg/m2）中,接种疫苗大菱鲆的（Scophthalmus maximus）血液、脾脏、头肾、鳃和皮肤中免疫指标变化规律,研究经接种疫苗操作后大菱鲆应对拥挤胁迫的应激响应。结果显示:血液中,LD组大菱鲆白细胞介素（1L-1β）、补体（C3）、免疫球蛋白M（IgM）、溶菌酶（LZM）和肿瘤坏死因子（TNF-α）等免疫指标显着高于MD、HD组（P<0.05）,通过基因表达分析发现LD组大菱鲆鳃组织中的主要组织相容性复合体（MHCⅡ）表达量显着高于MD、HD组（除了免疫后第三周）;LD组鳃中的IL1 β表达量也高于MD、HD密度组;LD组皮肤中TNF-α的表达量高于MD、HD同组织中的含量。2.拥挤胁迫对大菱鲆特异性免疫应答的影响通过监测不同养殖密度下大菱鲆阳性B淋巴细胞,特异性抗体IgM以及皮质醇含量的变化,研究拥挤胁迫对大菱鲆特异性免疫应答的影响。接种疫苗后,用流式细胞术检测大菱鲆血液,脾脏以及头肾中阳性免疫球蛋白（sIg+）的含量,结果表明,HD组sIg+细胞含量在免疫后第六周达到峰值,比低密度组和HD组峰值出现时间晚了一周。另外HD组大菱鲆在血液、脾脏和头肾中的sIg+细胞含量高峰值（血液41.37±3.18%,脾脏29.6±2.34%,头肾22.37±1.76%）显着低于 MD（血液46.73 ±3.18%,脾脏 33.28±2.68%,头肾24.57±2.32%,P<0.05）和 LD（血液 53.14±3.25%,脾脏 38.36±3.54%,头肾28.13±3.456%,P<0.05）。同时所有实验组大菱鲆特异性抗体含量在免疫后均开始上升,LD和MD在免疫后第5周达到峰值,而HD组的特异性抗体在第6周达到峰值。HD组皮质醇含量在最后3-4周时间里远高于MD和LD。整个结果表明,在低密度养殖条件下大菱鲆能够获得更好的免疫效果。同时我们发现HD组大菱鲆对于接下来的免疫刺激的反应能力有所下降。3.大菱鲆脾脏转录组数据分析为系统了解拥挤胁迫对大菱鲆免疫应答影响的转录组特征,我们选取了HD组和LD免疫后第5周的脾脏,共构建了 6个cDNA测序文库,进行了 RNA-seq测序及生物信息学分析。测序共得到447,000,000条平均长度为1274bp的序列。经过小片段去除和质量筛查后,共获得94%的高质量序列。这些高质量的序列经过拼接得到41,136unigenes。将得到的41136条Unigenes与NCBI的Nr经blast比对,其中22806条获得同源序列注释,占总数的55.44%,再将全部获得序列依次与Swissprot、KOG和KEGG数据库进行比对。经四大数据库比对后,共有22931条Unigenes获得了注释,占总数的55.74%。为了进一步了解转录组数据的完整性,对获得的41136个Unigenes进行了 COG功能注释。41136条Unigenes被注释到26个不同功能家族中,经比对发现涉及Signal transduction mechannisms功能的基因最多有7901条 Unigenes,其次是 General function prediction only 功能有 6112 条 Unigenes,然后 Posttranslation modification 功能有 3216 条 Unigenes 涉及为了进一步对Unigenes描述,对于获得的Unigenes进行GO注释。41136条Unigenes被注释到GO数据库中细胞组分、生物学过程和分子功能三大类55个分类中。其中生物学过程占了 23类,细胞组分占了 20类,分子功能占了 12类。在生物学过程中关于cellular process Unigenes最多为6462条,占15.7%。细胞组分中cell和cell part均占4630条Unigenes,占总的11.3%。分子功能中bing类有7120条Unigenes,占比最多为17.3%。利用RPKA值差异显着性（P<0.05）计算两组基因表达量,并用2-fold法进行数据统计和分析不同密度组之间的差异基因。总共获得397个差异表达基因,其中146个基因显着上调,251个基因显着下调。对大菱鲆脾脏转录组的测序,将有助于大菱鲆免疫组学相关研究工作的开展。4.大菱鲆头肾差异表达基因转录组数据分析经转录组测序后,将各样品所获得的原始reads数据进行过滤,首先去除带接头（adopter）的reads,然后去掉无法确定碱基信息占比超过10%的reads,最后去掉低质量的reads得到clean reads。将clean reads进行拼接组装,HD组获得 40762 条 unigenes,LD40843 条 unigenes。以 LDunigenes 作为基准,利用 RPKA值差异显着性（P<0.05）计算HD组基因表达量,并用2-fold法进行数据统计和分析。总共获得758个差异表达基因,其中100个基因显着上调,658个基因显着下调,下调基因远高于上调基因数。将所有差异表达基因进行GO分析,这些基因分属于生物过程、细胞组分和分子功能三大类下的42个分支,且均以下调为主。生物过程组中含有19个分支,其中细胞过程（cellular process）、单组织过程（single-organism process）和代谢过程（metabolic process）占比最高分别为23.48%,20.32%和17.94%;细胞组分组中有13个分支,其中细胞（cell）、细胞组分（cell part）和细胞器（organelle）占比最高,分别为15.17%,15.17%和11.74%;在分子功能分组中有10个分支,其中结合（binding）、催化活性（catalytic activity）和分子传导活性（molecular transducer activity）占比最高,分别为30.21%,18.47%和3.43%。差异表达基因的GO功能富集分析表明,拥挤胁迫下鱼体代谢和生物调控机能受到影响。通过 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路注释分析有助于我们了解基因产物、生物学功能、代谢途径以及酶催化之间的联系。把差异表达基因序列与KEGG数据库中的数据进行blastx比对注释,结果表明758个差异表达基因涉及KEGG新陈代谢（Metabolism）,遗传信息加工（Genetic Information Processing）,环境信息加工（Environmental Information Processing）,细胞过程（Cellular Processes）以及生物体系统（Organismal Systems）五大类的125个通路。其中p<0.05的显着差异通路有血管平滑肌收缩（Vascular smooth muscle contraction）、cGMP-PKN 信号通路（cGMP-PKG signaling pathway）、Rapl信号通路（Rapl signalingpathway）等14条通路,p<0.01的极显着差异通路有6条分别为焦点粘连（focal adhesion）,黏着连接（adherens junction）,FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）,黑色素生成（Melanogenesis）,ErbB 信号通路（ErbB signaling pathway）以及刺猬信号通路（Hedgehog signaling pathway）。对大菱鲆脾脏转录组的测序,将有助于大菱鲆免疫组学相关研究工作的开展。5.大菱鲆IL-4/13的鉴定与表达分析通过RT-PCR技术以及RACE技术获得IL-4/13基因的全长cDNA 1333bp,开放阅读框435bp,编码144个氨基酸,其中前端21个氨基酸经SignalP 4.1预测为信号肽,其余的123个氨基酸为成熟肽。构建进化树,结果表明大菱鲆IL4/13基因与鲈鱼的IL-4/13-2基因聚为一枝。设计荧光定量PCR引物在大菱鲆心、脾、肠、头肾、皮、肌、脑、肝及鳃中进行表达,发现在心、脾、肠和头肾中表达量较高。免疫注射发现,在免疫后各组织中表达含量均明显上升,说明IL-4/13在大菱鲆免疫应答中起重要作用;但是在不同密度组之间,各相同组织中表达量没有显着差异,说明拥挤胁迫对IL-4/13基因的表达没有显着影响。大菱鲆IL-4/13基因的获得为大菱鲆免疫的研究提供了一定的基础信息支持。
谢琳娜[10]（2017）在《胞质DNA对细胞还原四氮唑和葡萄糖代谢的影响及其机制探讨》文中研究指明病毒与宿主之间的相互作用一直备受人们的关注。一方面,病毒的蛋白质和基因组进入宿主细胞,会被识别为外源物质,从而引起一系列细胞应答反应。近年来,大量文献显示DNA病毒感染髓系细胞（Myeloid cells）时其基因组DNA进入细胞质中,成为胞质DNA。它可被cGAS所识别,并通过STING-TBK1-IRF3信号通路诱导一型干扰素IFNbeta和IL-6的表达和分泌,并最终引发细胞固有免疫应答。另外,有研究表明cGAS在一些非髓系细胞（Non-myeloid cells）,例如HEK293T细胞内低表达或不表达。并且在这些细胞内,胞质DNA无法诱导细胞表达并分泌IFNbeta或IL-6,但可诱导细胞发生凋亡。然而,其中的分子机制仍不明了。而胞质DNA是否除了诱导细胞固有免疫应答之外,还会引发其它细胞应答反应也不为人知。另一方面,细胞葡萄糖代谢是细胞生长和增殖所必需的。在病毒感染过程中,细胞葡萄糖代谢为病毒的复制提供核酸和蛋白质等合成原料,以及所需的能量。同时,细胞葡萄糖代谢会受病毒感染影响,而进行重编程,以适应或抵抗病毒的感染和复制。病毒与宿主细胞在代谢方面的相互作用仍有待进一步研究。本研究借助了胞质DNA诱发细胞固有免疫应答的研究模型——转染外源“干扰素刺激DNA（ISD）”模拟病毒DNA进入细胞质,研究胞质DNA引起的细胞代谢应答反应。首先,我们验证了胞质DNA刺激细胞24小时可抑制细胞的生长。有趣的是,不论是双链,还是单链的ISD均可引起上述现象,但腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的多聚物poly（dA）或单加转染试剂均无法引起上述现象,表明胞质DNA引起的这一效应具有一定的特异性。Annexin V/pI分析显示胞质DNA刺激24小时,大部分的细胞尚未进入凋亡程序。进而,我们通过四氮唑法对胞质DNA抑制细胞生长这一效应进行时间梯度分析。结果显示,胞质DNA刺激不到5小时即可显着抑制细胞对四氮唑的还原能力。实时荧光共聚焦显微观察证实,在转染后2小时内,外源DNA即可进入细胞质中。单独加入外源DNA或转染试剂无法抑制细胞对四氮唑的还原,表明DNA进入细胞质是产生这一效应所必需的。同时,多种序列的DNA,在多种细胞系中均能抑制细胞对四氮唑的还原。用单纯疱疹病毒（HSV-1）感染细胞也可抑制细胞对四氮唑的还原。上述结果表明病毒DNA进入细胞质中成为胞质DNA可导致细胞在代谢活力上出现异常。进而,我们在cGAS和STING敲除的小鼠成纤维L929细胞中证实胞质DNA引起的代谢应答并不依赖于cGAS和STING,并且胞质DNA引起的细胞代谢应答与细胞固有免疫应答相独立。为了进一步阐明四氮唑还原能力的下降具体意味着哪些代谢活力的变化,我们展开以下研究。根据细胞还原四氮唑的还原力主要来源于NADH或NAD（P）H,而细胞葡萄糖代谢是产生NADH或NAD（P）H的主要代谢途径,我们推测四氮唑的还原很可能与细胞葡萄糖代谢有关。因而,我们继而研究细胞葡萄糖代谢与四氮唑还原的相关性。结果显示细胞培养液中葡萄糖的有无可直接决定细胞还原四氮唑的能力。短时间的血清或谷氨酰胺饥饿并不会影响细胞对四氮唑的还原。同样,多方实验证据显示,短时间的葡萄糖饥饿并未导致细胞死亡。此外,葡萄糖的抑制剂2-DG和胞质DNA刺激的作用相似,均可抑制细胞对四氮唑的还原。这表明胞质DNA引起的细胞代谢应答很可能与葡萄糖代谢有关。进而,我们证实胞质DNA刺激可抑制细胞葡萄糖的摄入和乳酸的产生,导致细胞内ATP水平下降,并激活AMPK所介导的细胞能量应激反应。为了揭示胞质DNA诱导的细胞代谢应答的潜在分子机制,我们通过生物素-亲和素纯化系统和质谱分析系统鉴定出十余种潜在的胞质DNA结合蛋白。我们已有的研究证实其中AUF1可直接结合单链和双链DNA,但不与poly（dA）相结合。AUF1基因敲除可部分阻断胞质DNA对细胞还原四氮唑的抑制作用。有文献报道AUF1可调控GLUT1、PFK2等葡萄糖代谢的关键基因,上述结果表明AUF1可通过结合胞质DNA调节细胞葡萄糖代谢,引发细胞产生相应的代谢应答。综上所述,本研究证实胞质DNA可抑制细胞葡萄糖代谢,导致细胞内ATP水平和还原四氮唑能力的下降,并诱发AMPK介导的细胞能量应激反应。在这一过程中,AUF1是潜在的胞质DNA结合蛋白。这一研究结果提示宿主细胞在识别病毒基因组DNA后,存在着一定的分子机制,通过抑制细胞葡萄糖代谢和诱发细胞能量应激反应来限制病毒在细胞内的复制和扩增。这将成为细胞内的代谢屏障,与细胞间的免疫屏障相协同对抗病毒的感染和扩增。
二、葡萄糖调节蛋白的生物学特性及其在应激免疫应答中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、葡萄糖调节蛋白的生物学特性及其在应激免疫应答中的作用（论文提纲范文）
（1）不同免疫状态下鸡miRNA的表达特性及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 新城疫 |
| 1.2 应激性免疫抑制 |
| 1.3 miRNA |
| 1.3.1 miRNA与新城疫病毒 |
| 1.3.2 miRNA与免疫调控 |
| 1.3.3 循环miRNA与生物标记物 |
| 1.3.4 miR-375 与免疫调控 |
| 1.3.5 miR-20 与免疫调控 |
| 1.3.6 miR-19b与免疫调控 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 第2章 血清循环miRNA在免疫应答和应激性免疫抑制中的变化规律 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 疫苗与试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组与处理 |
| 2.2.2 血清制备 |
| 2.2.3 血清抗体检测 |
| 2.2.4 脏器系数测定 |
| 2.2.5 q RT-PCR检测血清循环miRNA的表达特性 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 免疫与免疫抑制模型的鉴定 |
| 2.3.2 ND组/对照组血清循环miRNA相对表达活性 |
| 2.3.3 Dex组/对照组血清循环miRNA相对表达活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 免疫应答和应激性免疫抑制模型的建立 |
| 2.4.2 新城疫疫苗免疫应答中血清循环miRNA的表达特性 |
| 2.4.3 地塞米松诱导的应激性免疫抑制中血清循环miRNA的表达特性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 应激性免疫抑制影响NDV疫苗免疫应答中血清循环miRNA的表达特性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 疫苗与试剂 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物分组与处理 |
| 3.2.2 血清制备 |
| 3.2.3 qRT-PCR检测血清循环miRNA的表达特性 |
| 3.2.4 统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 应激性免疫抑制条件下NDV免疫应答过程中循环miRNA的变化规律 |
| 3.3.2 从循环miRNA的角度分析应激性免疫抑制和NDV免疫应答的相互影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 应激性免疫抑制条件下NDV疫苗免疫反应中的循环miRNA表达特性分析 |
| 3.4.2 应激性免疫抑制和NDV疫苗免疫反应的相互影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 不同免疫状态下鸡miR-375 的组织表达特性与机制分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 疫苗与试剂 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 样品采集 |
| 4.2.2 同源性与进化性分析 |
| 4.2.3 鸡miR-375 的组织表达谱分析 |
| 4.2.4 miR-375 的生物信息学分析 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 miR-375 同源性和进化性分析 |
| 4.3.2 miR-375 扩增曲线和溶解曲线 |
| 4.3.3 新城疫疫苗免疫应答诱导miR-375 的组织表达特性 |
| 4.3.4 Dex诱导的应激性免疫抑制雏鸡miR-375 的组织表达特性 |
| 4.3.5 应激性免疫抑制条件下新城疫疫苗免疫应答中miR-375 的组织表达特性 |
| 4.3.6 miR-375 的生物信息学分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 miR-375 的同源性和进化性分析 |
| 4.4.2 新城疫疫苗免疫应答诱导miR-375 的组织表达特性分析 |
| 4.4.3 Dex诱导应激性免疫抑制雏鸡miR-375 的组织表达特性分析 |
| 4.4.4 应激性免疫抑制条件下新城疫疫苗免疫应答中循环miR-375 的表达特性分析 |
| 4.4.5 miR-375 的生物信息学分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 不同免疫状态下miR-19b的组织表达特性与机制分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 疫苗与试剂 |
| 5.1.3 引物 |
| 5.1.4 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 样品采集 |
| 5.2.2 同源性与进化性分析 |
| 5.2.3 鸡miR-19b的组织表达谱分析 |
| 5.2.4 miR-19b的生物信息学分析 |
| 5.2.5 统计分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 miR-19b同源性和进化性分析 |
| 5.3.2 miR-19b扩增曲线和溶解曲线 |
| 5.3.3 新城疫疫苗免疫应答诱导miR-19b的组织表达特性 |
| 5.3.4 Dex诱导的应激性免疫抑制雏鸡miR-19b的组织表达特性 |
| 5.3.5 应激性免疫抑制条件下新城疫疫苗免疫应答中miR-19b的组织表达特性 |
| 5.3.6 miR-19b的生物信息学分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 miR-19b的同源性和进化性分析 |
| 5.4.2 新城疫疫苗免疫应答诱导miR-19b的组织表达特性分析 |
| 5.4.3 Dex诱导应激性免疫抑制雏鸡miR-19b的组织表达特性分析 |
| 5.4.4 应激性免疫抑制条件下新城疫疫苗免疫应答中循环miR-19b的表达特性分析 |
| 5.4.5 miR-19b的生物信息学分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 不同免疫状态下miR-20 的组织表达特性与机制分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 疫苗与试剂 |
| 6.1.3 引物 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 样品采集 |
| 6.2.2 同源性与进化性分析 |
| 6.2.3 鸡miR-20 的组织表达谱分析 |
| 6.2.4 miR-20 的生物信息学分析 |
| 6.2.5 统计分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 miR-20 同源性和进化性分析 |
| 6.3.2 miR-20 扩增曲线和溶解曲线 |
| 6.3.3 新城疫疫苗免疫应答诱导miR-20 的组织表达特性 |
| 6.3.4 Dex诱导的应激性免疫抑制雏鸡miR-20 的组织表达特性 |
| 6.3.5 应激性免疫抑制条件下新城疫疫苗免疫应答中miR-20 的组织表达特性 |
| 6.3.6 miR-20 的生物信息学分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 miR-20 的同源性和进化性分析 |
| 6.4.2 新城疫疫苗免疫应答诱导miR-20 的组织表达特性分析 |
| 6.4.3 Dex诱导应激性免疫抑制雏鸡miR-20 的组织表达特性分析 |
| 6.4.4 应激性免疫抑制条件下新城疫疫苗免疫应答中循环miR-20 的表达特性分析 |
| 6.4.5 miR-20 的生物信息学分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（2）利用突变技术对HSV2 RL1、UL41和US12蛋白在病毒致病中的生物学机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 单纯疱疹病毒2型概述 |
| 单纯疱疹病毒2型的结构及其生物学特征 |
| 单纯疱疹病毒感染与宿主免疫应答 |
| 单纯疱疼病毒2型疫苗研究现状 |
| 单纯疱疹病毒2型感染与性激素 |
| 性类固醇激素及其受体 |
| 性类固醇激素调节免疫能力 |
| 性类固醇激素与能量代谢 |
| 研究思路 |
| 第一部分 HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 实验用动物 |
| 1.1.4 质粒与载体 |
| 1.1.5 试剂和商品化溶液 |
| 1.1.6 主要耗材 |
| 1.1.7 主要仪器设备 |
| 1.1.8 主要溶液及配置 |
| 1.1.9 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞传代 |
| 1.2.1.3 细胞冻存 |
| 1.2.1.4 细胞计数 |
| 1.2.2 病毒培养 |
| 1.2.2.1 病毒的扩增及收获 |
| 1.2.2.2 病毒滴度的测定 |
| 1.2.3 PX330质粒的构建 |
| 1.2.4 HSV-2突变株的构建 |
| 1.2.4.1 质粒转染 |
| 1.2.4.2 病毒感染 |
| 1.2.4.3 收获病毒 |
| 1.2.4.4 病毒核酸的提取 |
| 1.2.4.5 病毒基因组PCR鉴定 |
| 1.2.4.6 病毒克隆的筛选、扩增和鉴定 |
| 1.2.5 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在细胞水平的生物学特性分析 |
| 1.2.5.1 病毒增殖动力学测定 |
| 1.2.5.2 Vero细胞蚀斑形态分析 |
| 1.2.5.3 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4感染VK2细胞,细胞中免疫相关信号分子的表达分析 |
| 1.2.6 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的生物学特性分析 |
| 1.2.6.1 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的急性感染分析 |
| 1.2.6.2 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的潜伏感染分析 |
| 1.2.6.3 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的免疫原性分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 HSV-2突变毒株的构建和纯化 |
| 2.2 HSV-2 M2、M3、M4突变株在细胞水平的生物学特性分析 |
| 2.2.1 HSV-2 M2、M3、M4突变株病毒增殖动力学测定 |
| 2.2.2 HSV-2 M2、M3、M4突变株在Vero细胞上的蚀斑形态分析 |
| 2.2.3 HSV-2 M2、M3、M4突变株在VK2细胞中免疫相关信号分子转录水平检测 |
| 2.2.4 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的生物学特性分析 |
| 2.2.4.1 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的急性感染分析 |
| 2.2.4.2 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4在动物水平的潜伏感染分析 |
| 2.2.4.3 突变株HSV-2 M2、HSV-2 M3、HSV-2 M4的免疫原性分析 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 HSV-2突变株M1、HSV-2突变株M2、HSV-2突变株M3与野毒株感染后小鼠阴道、子宫和卵巢的转录组学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 商品化试剂 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 本试验所用细胞、病毒和病毒感染后动物水平与第一部分急性期感染相同,不同的内容如下: |
| 1.2.2 动物感染 |
| 1.2.3 HSV-2野毒株和HSV-2 M1突变株感染后小鼠阴道、子宫和卵巢转录组学检测分析 |
| 1.2.4 转录组数据分析 |
| 1.2.4.1 差异基因分层聚类(Heatmap) |
| 1.2.4.2 差异基因GO富集分析 |
| 1.2.4.3 差异基因KO富集分析 |
| 1.2.5 数据分析数据库和软件 |
| 1.2.6 HSV-2野毒株和HSV-2突变株M1感染VK2细胞后免疫和代谢相关分子检测 |
| 1.2.7 HSV-2野毒株和HSV-2突变株M1感染小鼠后血清中激素及其代谢相关分子检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠阴道、子宫和卵巢差异基因分析 |
| 2.1.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠阴道、子宫和卵巢差异基因总体概况 |
| 2.1.2 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠阴道差异基因分析 |
| 2.1.2.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株初HSV-2M3突变株感染后小鼠阴道差异基因GO富集分析 |
| 2.1.2.2 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠阴道差异基因KEGG分析 |
| 2.1.3 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠子宫差异基因分析 |
| 2.1.3.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠子宫差异基因GO富集分析 |
| 2.1.3.2 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠子宫差异基因KEGG分析 |
| 2.1.4 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2 M3突变株感染后小鼠卵巢差异基因分析 |
| 2.1.4.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠卵巢差异基因GO富集分析 |
| 2.1.4.1 HSV-2野毒株、HSV-2 M1突变株、HSV-2 M2突变株和HSV-2M3突变株感染后小鼠卵巢差异基因KEGG富集分析 |
| 2.1.5 HSV-2野毒株、HSV-2突变株M1、HSV-2突变株M2和HSV-2突变株M3感染后小鼠阴道、子宫和卵巢性类固醇激素相关基因热图分析 |
| 2.1.6 HSV-2野毒株、HSV-2突变株M1、HSV-2突变株M2和HSV-2突变株M3感染后小鼠阴道、子宫和卵巢细胞色素相关基因热图分析 |
| 2.2 HSV-2野毒株和HSV-2突变株M1感染VK2细胞后代谢相关分子检测分析 |
| 2.3 HSV-2野毒株和HSV-2突变株M1感染小鼠后血清中激素及其代谢相关分子检测分析 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 单纯疱疹病毒与天然免疫系统的相互作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 研究生个人简历 |
（3）刺参应对高温低氧胁迫的生理响应与分子调控特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1 章 研究背景 |
| 1.1 高温胁迫下水生生物的响应特征 |
| 1.1.1 典型水生生物的温度耐受区间 |
| 1.1.2 高温胁迫对水生动物生理行为的影响 |
| 1.1.3 高温胁迫对水生动物分子调控的影响 |
| 1.2 低氧胁迫下水生生物的响应特征 |
| 1.2.1 低氧胁迫下水生生物的耐受性差异 |
| 1.2.2 低氧胁迫对水生生物生理行为的影响 |
| 1.2.3 低氧胁迫对水生动物分子调控的影响 |
| 1.3 刺参应对高温胁迫的响应机制研究进展 |
| 1.3.1 生理行为层面 |
| 1.3.2 分子响应层面 |
| 1.4 刺参应对低氧胁迫的响应机制研究进展 |
| 1.4.1 生理行为层面 |
| 1.4.2 分子响应层面 |
| 1.5 研究目的、意义及研究思路 |
| 1.5.1 目的与意义 |
| 1.5.2 科学问题 |
| 1.5.3 研究内容与技术路线 |
| 1.5.4 预期成果 |
| 1.6 本章小结 |
| 第2 章 高温低氧胁迫下刺参生理行为变化 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 样品收集 |
| 2.2.2 酶活力测定及统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 高温低氧下刺参的消化功能相关酶活变化 |
| 2.3.2 高温低氧下刺参的免疫防御相关酶活变化 |
| 2.3.3 高温低氧下刺参的氧化应激相关酶活变化 |
| 2.3.4 高温低氧下刺参的生理行为变化特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 高温低氧胁迫下刺参消化功能相关变化 |
| 2.4.2 高温低氧胁迫下刺参免疫防御相关变化 |
| 2.4.3 高温低氧胁迫下刺参氧化应激相关变化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 高温低氧胁迫下刺参m RNA及 lnc RNA调控特征 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 样品收集 |
| 3.2.2 建库及测序 |
| 3.2.3 数据质控、比对及鉴定 |
| 3.2.4 基因表达水平的定量及差异分析 |
| 3.2.5 差异表达基因(DEG)的GO和 KEGG富集分析 |
| 3.2.6 Real-time PCR验证及数据处理 |
| 3.2.7 靶向预测和验证 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 m RNA和 lnc RNA测序概况、鉴定及差异表达分析 |
| 3.3.2 差异lnc RNA和 m RNA的转录水平验证 |
| 3.3.3 DE-m RNA和 DE-lnc RNA的基因本体论(GO)和通路分析 |
| 3.3.4 m RNA和 lnc RNA的关联分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 高温低氧胁迫下刺参micro RNA调控特征 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 样品采集 |
| 4.2.2 小RNA文库的构建和测序 |
| 4.2.3 序列数据分析 |
| 4.2.4 Real-time PCR验证 |
| 4.2.5 mi RNA靶标预测、GO富集和KEGG通路分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 mi RNA文库构建概况 |
| 4.3.2 差异mi RNA及 real-time PCR验证 |
| 4.3.3 差异mi RNA靶基因的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 4.3.4 对环境胁迫响应的关键DE-mi RNA |
| 4.3.5 与高温和低氧胁迫相关的重要分子网络 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5 章 高温低氧胁迫下刺参蛋白表达水平变动特征 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 样品收集 |
| 5.2.2 样品处理及蛋白质提取 |
| 5.2.3 蛋白酶解、肽段标记及分离与质谱检测 |
| 5.2.4 蛋白质鉴定和定量 |
| 5.2.5 COG、GO和 KEGG通路富集分析 |
| 5.2.6 Real-time PCR及数据处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 蛋白质表达谱概述及差异蛋白分析 |
| 5.3.2 基于差异蛋白的COG分析和KEGG富集分析 |
| 5.3.3 基于差异蛋白的GO分析及关键过程变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 信号转导 |
| 5.4.2 蛋白质合成 |
| 5.4.3 免疫防御 |
| 5.4.4 能量产生与转移 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6 章 高温低氧胁迫下刺参代谢物变动特征 |
| 6.1 研究背景 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 样品收集 |
| 6.2.2 样品处理及代谢物提取 |
| 6.2.3 UPLC-MS分析 |
| 6.2.4 多元统计 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 代谢组结果概述 |
| 6.3.2 各种环境胁迫下刺参关键响应差异代谢物 |
| 6.3.3 刺参应对高温低氧胁迫的潜在候选生物标志物 |
| 6.3.4 TCA循环中的关键代谢物水平分析 |
| 6.3.5 基于差异代谢物的关键通路分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 高温胁迫下刺参的代谢物水平变化 |
| 6.4.2 低氧胁迫下刺参的代谢物水平变化 |
| 6.4.3 高温低氧胁迫下刺参的代谢物水平变化 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7 章 高温低氧胁迫下刺参关键免疫因子的响应特征 |
| 7.1 研究背景 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 样品收集 |
| 7.2.2 数据获取与分析 |
| 7.3 实验结果与讨论 |
| 7.3.1 NF-κB通路相关基因表达 |
| 7.3.2 蛋白酶相关基因表达 |
| 7.3.3 补体系统相关基因表达 |
| 7.3.4 热休克蛋白家族相关基因表达 |
| 7.3.5 转铁蛋白家族成员和其他免疫相关基因的表达 |
| 7.3.6 刺参免疫系统应对环境胁迫的响应 |
| 7.4 本章小结 |
| 第8 章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 创新性 |
| 8.3 存在问题 |
| 8.4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）三种大豆蛋白源致珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Elanceolatus♂）肠道黏膜屏障损伤的差异机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物蛋白源替代鱼粉研究 |
| 1.1.1 大豆蛋白的主要种类及特性 |
| 1.1.2 大豆蛋白源替代鱼粉的研究 |
| 1.2 鱼类豆粕诱导型肠炎研究进展 |
| 1.3 鱼类肠道菌群 |
| 1.3.1 鱼类肠道菌群的形成与组成 |
| 1.3.2 营养物质对肠道菌群的影响 |
| 1.3.3 肠道菌群的营养和免疫功能 |
| 1.4 肠道健康的重要性 |
| 1.4.1 肠道机械屏障 |
| 1.4.2 肠道化学屏障 |
| 1.4.3 肠道生物屏障 |
| 1.4.4 肠道免疫屏障 |
| 1.5 组学技术简介 |
| 1.5.1 16S高通量测序 |
| 1.5.2 全长转录组 |
| 1.5.3 代谢组学 |
| 1.6 本研究总体设计及研究策略 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究目标 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 1.6.4 技术路线 |
| 2 普通豆粕对珍珠龙胆肠道黏膜屏障损伤的机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验饲料与制备 |
| 2.2.2 实验过程 |
| 2.2.3 样品收集 |
| 2.2.4 常规分析及肠道切片制作 |
| 2.2.5 生化指标分析 |
| 2.2.6 肠道结构基因表达 |
| 2.2.7 肠道免疫基因表达 |
| 2.2.8 肠道菌群16S高通量分析 |
| 2.2.9 转录组分析 |
| 2.2.10 代谢组学分析 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 生长表现及常规分析 |
| 2.3.2 肠道组织切片 |
| 2.3.3 酶活测定 |
| 2.3.4 基因表达 |
| 2.3.5 16S高通量测序 |
| 2.3.6 转录组分析 |
| 2.3.7 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 2.3.8 肠道内容物UPLC-MS代谢谱分析 |
| 2.3.9 肠道组织UPLC-MS代谢谱分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 大豆浓缩蛋白对珍珠龙胆肠道黏膜屏障损伤的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验饲料与制备 |
| 3.2.2 实验过程 |
| 3.2.3 样品收集 |
| 3.2.4 常规分析及肠道切片 |
| 3.2.5 生化指标分析 |
| 3.2.6 肠道结构基因表达 |
| 3.2.7 肠道免疫基因表达 |
| 3.2.8 肠道菌群16S高通量测序 |
| 3.2.9 转录组分析 |
| 3.2.10 统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 生长表现及常规分析 |
| 3.3.2 肠道组织切片 |
| 3.3.3 酶活测定 |
| 3.3.4 基因表达 |
| 3.3.5 16S高通量测序 |
| 3.3.6 转录组比较分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 发酵豆粕对珍珠龙胆肠道黏膜屏障损伤的机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验饲料与制备 |
| 4.2.2 实验过程 |
| 4.2.3 样品收集 |
| 4.2.4 常规分析及肠道切片 |
| 4.2.5 生化指标分析 |
| 4.2.6 肠道结构基因表达 |
| 4.2.7 肠道免疫基因表达 |
| 4.2.8 肠道菌群16S高通量测序 |
| 4.2.9 转录组分析 |
| 4.2.10 统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 生长表现及常规分析 |
| 4.3.2 肠道组织切片 |
| 4.3.3 酶活测定 |
| 4.3.4 基因表达 |
| 4.3.5 16S高通量测序 |
| 4.3.6 转录组比较分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 不同大豆蛋白源对珍珠龙胆肠道黏膜屏障损伤机制研究比较 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 生长表现及常规分析 |
| 5.2.2 肠道组织切片 |
| 5.2.3 酶活测定 |
| 5.2.4 基因表达 |
| 5.2.5 16S高通量测序 |
| 5.2.6 转录组比较分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 全文总结 |
| 7 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（5）壳寡糖免疫增强及对肾癌抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 肾癌的研究进展 |
| 1.3 抗肿瘤天然糖类研究进展 |
| 1.4 壳寡糖的研究进展 |
| 1.4.1 壳寡糖的理化性质 |
| 1.4.2 壳寡糖的生物活性 |
| 1.5 壳寡糖抗肿瘤机制研究进展 |
| 1.6 活性氧与内质网氧化应激 |
| 1.7 本文的主要研究内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器设备 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 试剂及药品 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 体外细胞实验 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 COS对不同细胞增殖活力测定 |
| 2.2.3 COS对细胞周期的影响 |
| 2.2.4 COS对肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 2.2.5 中性红吞噬试验 |
| 2.2.6 NO、TNF-α和 IL-6 含量测定 |
| 2.2.7 彗星电泳试验 |
| 2.2.8 COS对线粒体膜电位的影响 |
| 2.2.9 COS对活性氧表达的影响 |
| 2.2.10 RNA的提取 |
| 2.2.11 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.2.12 COS对胞内钙离子浓度的影响 |
| 2.2.13 蛋白印迹实验 |
| 2.2.14 表达luc-GFP细胞的建立 |
| 2.2.15 COS的Cy7荧光标记 |
| 2.2.16 COS及 COS-Cy7 的表征 |
| 2.3 体内动物实验 |
| 2.3.1 不同动物模型制备及分组 |
| 2.3.2 小鼠体重及脏器指数的测定 |
| 2.3.3 肿瘤抑制率的测定 |
| 2.3.4 小鼠巨噬细胞吞噬功能的测定 |
| 2.3.5 小鼠脾细胞悬液的制备及增殖测定 |
| 2.3.6 小鼠脾细胞NK细胞活力测定 |
| 2.3.7 T淋巴细胞亚群的测定 |
| 2.3.8 血清中TNF-α的检测 |
| 2.3.9 肿瘤的组织病理学及免疫组化检测 |
| 2.4 统计分析 |
| 第3章 壳寡糖的免疫增强作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 COS的理化性质和结构分析 |
| 3.3 COS对巨噬细胞RAW264.7 的调节作用 |
| 3.3.1 COS对 RAW264.7 细胞增殖及吞噬功能的影响 |
| 3.3.2 COS对 RAW264.7 细胞炎性因子分泌的影响 |
| 3.4 COS对 RAW264.7 的转录组测序差异分析 |
| 3.5 COS对正常小鼠的影响 |
| 3.6 COS对化疗药物CTX诱导的免疫低下小鼠的影响 |
| 3.6.1 对免疫器官指数及单核吞噬功能的影响 |
| 3.6.2 对脾淋巴细胞转化和NK细胞活力的影响 |
| 3.7 COS对放射损伤小鼠的影响 |
| 3.8 COS对S180皮下移植瘤术后残瘤小鼠的影响 |
| 3.8.1 COS对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 3.8.2 COS对 S180 荷瘤小鼠脾T细胞和NK细胞的影响 |
| 3.8.3 COS对 S180 荷瘤小鼠血浆中T细胞和TNF-α的影响 |
| 3.8.4 肿瘤组织形态及免疫组化分析 |
| 3.9 COS免疫增强作用分析 |
| 3.10 本章小结 |
| 第4章 壳寡糖对肾原位癌的抑制作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 COS的生物分布研究 |
| 4.2.1 COS-Cy7的合成 |
| 4.2.2 COS-Cy7的体内分布研究 |
| 4.3 肾原位移植瘤模型的建立 |
| 4.3.1 稳定表达luc-GFP的 KCC853 细胞的构建 |
| 4.3.2 肾癌KCC853-luc-GFP裸鼠肾原位移植瘤生物发光模型的建立 |
| 4.4 COS对裸鼠肾原位癌的抑制作用 |
| 4.4.1 COS对 KCC853 实体瘤生长的抑制作用 |
| 4.4.2 肿瘤组织形态及免疫组化分析 |
| 4.4.3 血清中生化指标的检测 |
| 4.5 COS辅助放疗对裸鼠肾原位癌的抑制作用 |
| 4.5.1 COS辅助放疗对KCC853 实体瘤生长的抑制作用 |
| 4.5.2 COS辅助放疗对KCC853 荷瘤鼠体重及脾指数的影响 |
| 4.5.3 肿瘤组织形态及免疫组化分析 |
| 4.6 COS辅助化疗对裸鼠肾原位癌的抑制作用 |
| 4.6.1 COS辅助化疗对抑制KCC853 实体瘤生长的增效作用 |
| 4.6.2 COS辅助化疗对裸鼠肾原位癌的减毒作用 |
| 4.7 本章小结 |
| 第5章 壳寡糖对肾癌的抑制作用机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 COS对肾癌细胞的增殖抑制 |
| 5.2.1 COS对肾癌细胞生长的抑制作用 |
| 5.2.2 COS对肾癌细胞周期的影响 |
| 5.2.3 COS对肾癌细胞凋亡的影响 |
| 5.2.4 COS对肾癌细胞DNA损伤的影响 |
| 5.3 COS对肾癌细胞的信号通路分析 |
| 5.3.1 差异表达基因GO富集分析 |
| 5.3.2 差异表达基因KEGG富集分析 |
| 5.4 COS对肾癌细胞的内质网应激作用 |
| 5.4.1 COS对肾癌细胞线粒体膜电位的影响 |
| 5.4.2 COS对肾癌细胞活性氧表达的影响 |
| 5.4.3 COS对肾癌细胞活性氧相关m RNA表达的影响 |
| 5.4.4 COS对肾癌细胞胞内钙离子浓度的影响 |
| 5.4.5 COS对肾癌细胞内质网应激相关蛋白表达的影响 |
| 5.5 COS对肾癌的抑制作用机制讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 血吸虫及我国血吸虫病的流行及防控形势 |
| 1.1.2 日本血吸虫生活史及宿主的适宜性 |
| 1.1.2.1 日本血吸虫生活史 |
| 1.1.2.2 宿主适宜性 |
| 1.1.2.3 水牛和黄牛是我国血吸虫病主要传染源 |
| 1.1.3 血吸虫感染的免疫 |
| 1.1.3.1 宿主对血吸虫感染的天然免疫应答 |
| 1.1.3.2 宿主对血吸虫感染的适应性免疫应答 |
| 1.1.4 micro RNA及其在血吸虫上的研究 |
| 1.1.4.1 血吸虫宿主miRNA研究进展 |
| 1.1.4.2 虫体miRNA研究进展 |
| 1.1.5 真核翻译起始因子eIF4A研究进展 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.3.1 黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 1.3.2 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析 |
| 1.3.3 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析 |
| 1.3.4 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析 |
| 第二章 黄牛与水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 水牛和黄牛来源日本血吸虫成虫的收集 |
| 2.3.2 虫体RNA的提取 |
| 2.3.3 small RNA文库构建 |
| 2.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 2.3.5 已知显着性差异表达的miRNAs验证 |
| 2.3.5.1 引物设计 |
| 2.3.5.2 虫体miRNA提取 |
| 2.3.5.3 miRNA cDNA第一链合成 |
| 2.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 2.3.6 差异表达miRNAs的靶基因筛选及q RT-PCR验证 |
| 2.3.7 双荧光素酶验证实验 |
| 2.3.7.1 HEK293T细胞的培养 |
| 2.3.7.2 双荧光素酶共表达载体的构建 |
| 2.3.7.3 转染实验 |
| 2.3.7.4 双荧光素酶报告基因活性检测 |
| 2.3.8 数据分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 2.4.2 黄牛和水牛源日本血吸虫已知miRNAs的比较分析 |
| 2.4.3 日本血吸虫成虫新miRNA的初步鉴定 |
| 2.4.4 采用qRT-PCR法验证五个差异表达的已知miRNAs |
| 2.4.5 五个显着性差异表达miRNAs的靶基因预测 |
| 2.4.6 靶基因的功能富集分析 |
| 2.4.7 采用qRT-PCR验证差异表达miRNAs的靶基因 |
| 2.4.8 双荧光素酶验证结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 黄牛和水牛外周血的采集及血浆分离 |
| 3.3.2 血浆RNA的提取 |
| 3.3.3 small RNA文库构建 |
| 3.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 3.3.5 差异表达miRNAs的 q RT-PCR验证 |
| 3.3.5.1 差异表达miRNAs的引物设计 |
| 3.3.5.2 血浆miRNA提取及反转录 |
| 3.3.5.3 miRNA c DNA第一链合成 |
| 3.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 3.3.6 差异表达miRNAs的靶基因的q RT-PCR验证 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 3.4.2 黄牛和水牛血浆已知miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.1 黄牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.2 水牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.3 T1、T2、T3 时期黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.4 黄牛和水牛感染血吸虫后血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.3 黄牛和水牛血浆新miRNAs的预测分析 |
| 3.4.4 差异表达miRNAs靶基因预测及靶基因功能的生物信息学分析 |
| 3.4.4.1 黄牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.2 水牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.3 黄牛和水牛在T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.4 感染后不同时期黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.5 黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs及其靶基因验证 |
| 3.4.5.1 黄牛和水牛各时期血浆差异表达miRNAs的验证 |
| 3.4.5.2 血浆差异miRNAs的靶基因验证 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 黄牛和水牛外周血的采集及PBMC的分离 |
| 4.3.2 PBMC中 RNA的提取 |
| 4.3.3 small RNA文库构建 |
| 4.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 4.3.5 差异表达miRNAs的 q RT-PCR验证 |
| 4.3.5.1 差异表达miRNAs的引物设计 |
| 4.3.5.2 PBMC中 miRNA的提取 |
| 4.3.5.3 miRNA c DNA第一链合成 |
| 4.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 4.3.6 差异表达miRNAs的靶基因预测及q RT-PCR验证 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 4.4.2 黄牛和水牛PBMC新 miRNAs的预测分析 |
| 4.4.3 黄牛和水牛PBMC已知miRNAs的比较分析 |
| 4.4.3.1 黄牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs筛选及分析 |
| 4.4.3.2 水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs筛选及分析 |
| 4.4.3.3 T1、T2、T3 时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的比较分析 |
| 4.4.3.4 不同感染时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的比较分析 |
| 4.4.4 差异表达miRNAs的靶基因预测及靶基因功能的生物信息学分析 |
| 4.4.4.1 黄牛T1、T2、T3 时期PBMC差异miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.2 水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.3 黄牛和水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.4 感染后不同时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.5 黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs及其靶基因验证 |
| 4.4.5.1 黄牛和水牛各时期PBMC差异miRNAs的验证 |
| 4.4.5.2 PBMC差异miRNAs的靶基因验证 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物和尾蚴 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器及设备 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 Sj-eIF4A的生物信息学分析 |
| 5.3.2 Sj-eIF4A在日本血吸虫不同发育时期虫体内的转录水平分析 |
| 5.3.2.1 不同发育时期的虫体收集 |
| 5.3.2.2 虫体RNA提取 |
| 5.3.2.3 虫体RNA反转为c DNA及 q RT-PCR分析 |
| 5.3.3 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同适宜性宿主来源虫体内的转录水平分析 |
| 5.3.3.1 不同宿主来源虫体的收集 |
| 5.3.3.2 虫体RNA的提取 |
| 5.3.3.3 虫体RNA反转为c DNA及 q RT-PCR分析 |
| 5.3.4 原核表达质粒的构建 |
| 5.3.5 重组蛋白r Sj-eIF4A的表达与纯化 |
| 5.3.6 Sj-eIF4A基因特异性si RNA的筛选 |
| 5.3.6.1 Sj-eIF4A基因si RNA的合成 |
| 5.3.6.2 虫体的收集与体外培养 |
| 5.3.6.3 Sj-eIF4A基因的干扰效果分析 |
| 5.3.7 Sj-eIF4A基因体外最佳干扰时间的筛选 |
| 5.3.8 Sj-eIF4A基因的体内干扰实验 |
| 5.3.9 Sj-eIF4A基因的体外干扰实验 |
| 5.3.9.1 虫体收集与RNA长期干扰 |
| 5.3.9.2 体外长期干扰虫体结构变化观察 |
| 5.3.10 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 Sj-eIF4A基因的扩增与重组表达质粒的构建 |
| 5.4.2 日本血吸虫Sj-eIF4A基因的生物信息学分析 |
| 5.4.3 r Sj-eIF4A蛋白的纯化 |
| 5.4.4 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同发育时期的转录水平分析 |
| 5.4.5 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同适宜性宿主来源虫体内的转录水平分析 |
| 5.4.6 siRNA干扰效果分析 |
| 5.4.7 RNA干扰引起Sj-eIF4A基因沉默的最佳时间分析 |
| 5.4.8 体内干扰Sj-eIF4A基因表达对虫荷数和肝脏虫卵数的影响 |
| 5.4.9 体外干扰Sj-eIF4A基因表达对虫卵的影响 |
| 5.4.10 体外干扰Sj-eIF4A基因对虫体形态的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文讨论与总结 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.1.1 黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 6.1.2 黄牛和水牛血浆miRNA在日本血吸虫感染前后的表达谱分析 |
| 6.1.3 黄牛和水牛外周血单核细胞miRNA在日本血吸虫感染前后的表达谱分析 |
| 6.1.4 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A基因的克隆表达与特性分析 |
| 6.2 全文总结 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 日本血吸虫 miRNA 测序流程图及Hsc20 扩增序列 |
| 附录 B 攻读博士学位期间主要学术成果和参加学术会议情况 |
（7）日本囊对虾高温胁迫响应机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语中英文对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 日本囊对虾简介 |
| 1.1.1 日本囊对虾生物学特性 |
| 1.1.2 日本囊对虾养殖产业现状 |
| 1.2 水温对对虾的影响 |
| 1.2.1 水温对对虾生长和存活的影响 |
| 1.2.2 水温对对虾发育的影响 |
| 1.2.3 水温对对虾生殖的影响 |
| 1.2.4 水温对对虾免疫应答的影响 |
| 1.2.5 水温对对虾行为的影响 |
| 1.3 水生动物高温胁迫响应机制研究进展 |
| 1.3.1 热休克因子-热休克蛋白调控途径 |
| 1.3.2 抗氧化系统 |
| 1.3.3 物质和能量代谢调节 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 日本囊对虾响应高温胁迫的转录组学研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试剂配方 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 高温胁迫实验和采样 |
| 2.2.2 RNA提取及质量检测 |
| 2.2.3 mRNA文库构建、质控及测序 |
| 2.2.4 生物信息学分析 |
| 2.2.5 荧光定量PCR验证差异表达基因 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 测序数据统计 |
| 2.3.2 转录组组装与比对结果 |
| 2.3.3 差异表达基因的鉴定 |
| 2.3.4 差异表达基因的功能注释和通路分析 |
| 2.3.5 差异表达基因的聚类分析 |
| 2.3.6 转录组数据的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 转录组测序质量和功能注释分析 |
| 2.4.2 高温胁迫对日本囊对虾免疫功能的影响 |
| 2.4.3 高温胁迫下日本囊对虾的抗氧化和热休克应答 |
| 2.4.4 高温胁迫对日本囊对虾物质和能量代谢的影响 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 日本囊对虾高温胁迫下的microRNA表达谱分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 试剂配方 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 高温胁迫实验和采样 |
| 3.2.2 RNA提取及质量检测 |
| 3.2.3 Small RNA文库构建、质控及测序 |
| 3.2.4 生物信息学分析 |
| 3.2.5 荧光定量PCR验证差异表达miRNA |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 测序数据统计 |
| 3.3.2 miRNA鉴定 |
| 3.3.3 差异表达miRNA鉴定 |
| 3.3.4 靶基因预测和功能注释 |
| 3.3.5 差异表达miRNA的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 日本囊对虾miRNA的鉴定与发掘 |
| 3.4.2 日本囊对虾高温胁迫响应miRNA的筛选 |
| 3.4.3 日本囊对虾高温胁迫响应miRNA的功能分析 |
| 3.4.4 抗白斑综合征病毒miRNA的挖掘 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 高温胁迫下日本囊对虾的抗氧化应答和组织病理变化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试剂配方 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 高温胁迫实验和采样 |
| 4.2.2 日本囊对虾MjSeGpx和MjGSTMu基因的克隆和序列分析 |
| 4.2.3 荧光定量PCR |
| 4.2.4 抗氧化酶活性和丙二醛含量检测 |
| 4.2.5 组织病理学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 日本囊对虾MjSeGpx和MjGSTMu基因的克隆和序列分析 |
| 4.3.2 日本囊对虾MjSeGpx和MjGSTMu基因表达的组织分布 |
| 4.3.3 日本囊对虾MjSeGpx和MjGSTMu在高温胁迫下的表达模式 |
| 4.3.4 高温胁迫下日本囊对虾抗氧化酶活性和丙二醛含量变化 |
| 4.3.5 高温胁迫下日本囊对虾肝胰腺组织病理变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 日本囊对虾MjSeGpx和MjGSTMu基因的克隆和表达分析 |
| 4.4.2 日本囊对虾高温胁迫下的氧化损伤和抗氧化应答 |
| 4.4.3 日本囊对虾高温胁迫下的组织病理变化 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 日本囊对虾热休克蛋白和热休克因子基因的表达及功能研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 试剂配方 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 高温胁迫实验和采样 |
| 5.2.2 日本囊对虾MjHSP10和MjHSF1基因的克隆和序列分析 |
| 5.2.3 荧光定量PCR |
| 5.2.4 日本囊对虾MjHSP10和MjHSF1间的蛋白互作分析 |
| 5.2.5 日本囊对虾MjHSF1沉默对MjHSP10基因表达的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 日本囊对虾MjHSP10和MjHSF1基因的克隆和序列分析 |
| 5.3.2 日本囊对虾MjHSP10和MjHSF1基因表达的组织分布 |
| 5.3.3 不同温度胁迫下日本囊对虾HSPs和MjHSF1的表达模式 |
| 5.3.4 日本囊对虾MjHSP10和MjHSF1间的蛋白互作分析 |
| 5.3.5 日本囊对虾MjHSF1沉默后MjHSP10基因的表达变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 日本囊对虾MjHsP10和MjHSF1基因的克隆和表达分析 |
| 5.4.2 日本囊对虾MjHSPIO和MjHSF1间的相互作用 |
| 5.5 结论 |
| 结语 |
| 主要结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间参与的项目和成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）基于转录组学和代谢组学研究三丁基氯化锡对暗纹东方鲀幼鱼的毒理学机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 三丁基锡(TBT)的生态毒理学研究进展 |
| 1.1 三丁基锡简介 |
| 1.2 三丁基锡的理化性质及应用 |
| 1.3 三丁基锡在环境中的残留情况 |
| 1.4 三丁基锡的毒理学研究进展 |
| 1.5 三丁基锡对人类健康的影响 |
| 2 转录组测序技术在水生毒理学的应用 |
| 2.1 转录组学概述 |
| 2.2 转录组测序进展及概述 |
| 2.3 转录组测序数据的分析与挖掘 |
| 2.4 转录组学在水生动物免疫应答中的应用 |
| 2.5 转录组技术对水生生物毒理学的应用 |
| 3 代谢组学在水生生物毒理学上的应用 |
| 3.1 代谢组学的发展 |
| 3.2 代谢组测试方法 |
| 3.3 代谢组学分析方法 |
| 3.4 代谢组学在水生生物毒理上的应用 |
| 4 本研究的目的意义 |
| 第二章 三丁基氯化锡对暗纹东方鲀的急性毒性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验用水 |
| 2.3 实验药物 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 数据处理及统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 TBT-Cl暴露后暗纹东方鲀肝脏转录组学的比较研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.3 毒性实验与取材 |
| 2.4 cDNA文库构建和转录组测序 |
| 2.5 测序组装与质控分析 |
| 2.6 序列比对 |
| 2.7 差异基因分析 |
| 2.8 差异表达基因的qRT-PCR验证 |
| 2.9 统计分析 |
| 2.10 数据储存 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 转录组测序数据组装和分析 |
| 3.2 转录组测序数据及比对分析 |
| 3.3 GO富集分析 |
| 3.4 KOG注释 |
| 3.5 KEGG富集分析 |
| 3.6 差异表达基因分析结果 |
| 3.7 差异基因的qRT-PCR验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 实验设计与转录组测序 |
| 4.2 转录组测序结果 |
| 4.3 差异表达基因的筛选 |
| 4.4 富集通路的功能分析 |
| 4.5 差异表达基因的功能分析与验证 |
| 5 小结 |
| 第四章 暗纹东方鲀HSP90β1基因的克隆、表达与TBT-Cl应激研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验与组织取材 |
| 2.2 主要试剂与实验仪器 |
| 2.3 总RNA提取及cDNA制备 |
| 2.4 To-HSP90β1基因全长的获得 |
| 2.5 生物信息学分析 |
| 2.6 qRT-PCR检测 |
| 2.7 HSP90β1蛋白组织定位 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RNA的提取 |
| 3.2 To-HSP90β1 cDNA的特性 |
| 3.3 多序列比对和系统进化分析 |
| 3.4 To-HSP90β1组织表达 |
| 3.5 TBT C1暴露后的时空表达模式 |
| 3.6 HSP90β1蛋白的组织定位 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 TBT-Cl暴露后暗纹东方鲀血清和肝脏的代谢组学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验生物 |
| 2.2 实验用水 |
| 2.3 实验药物 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 血清代谢组 |
| 3.2 肝脏代谢组 |
| 4 讨论 |
| 4.1 代谢组测试结果 |
| 4.2 差异代谢物及相关通路的变化 |
| 5 小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间科研成果目录 |
（9）拥挤胁迫对大菱鲆接种迟钝爱德华氏菌减毒活疫苗免疫应答的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大菱鲆养殖现状与迟钝爱德华氏菌病 |
| 2 拥挤胁迫对鱼类的影响 |
| 2.1 拥挤胁迫对鱼类生长的影响 |
| 2.2 拥挤胁迫对鱼类代谢水平的影响 |
| 2.3 拥挤胁迫对鱼类应激的影响 |
| 2.4 拥挤胁迫对鱼类免疫系统的影响 |
| 3 鱼类适应性免疫系统 |
| 3.1 鱼类适应性免疫系统对抗原的识别加工 |
| 3.2 抗原传递 |
| 3.3 适应性免疫应答 |
| 4 转录组测序在水产动物上的应用 |
| 4.1 转录组学在鱼类免疫学中的运用 |
| 4.2 转录组学在鱼类发育生物学中的运用 |
| 4.3 转录组学在鱼类进化生物学中的运用 |
| 4.4 转录组学技术在水产动物毒理学中的运用 |
| 5 IL-4的研究进展 |
| 5.1 IL-4基因 |
| 5.2 IL-4的生物学功能 |
| 5.3 鱼类IL-4基因的研究现状 |
| 6 技术路线 |
| 第二章 拥挤胁迫对接种疫苗大菱鲆的免疫应答影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用鱼和实验设施 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 RNA的提取 |
| 1.6 cDNA的合成 |
| 1.7 实时荧光定量PCR |
| 1.8 免疫因子检测 |
| 1.9 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 拥挤胁迫对大菱鲆血液免疫因子的影响 |
| 2.2 拥挤胁迫对大菱鲆免疫基因的影响 |
| 2.2.1 拥挤胁迫对大菱鲆1L-1β基因的影响 |
| 2.2.2 拥挤胁迫对大菱鲆MHCⅡ基因的影响 |
| 2.2.3 拥挤胁迫对大菱鲆TNF-α基因的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 拥挤胁迫对接种疫苗大菱鲆B淋巴细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用鱼同第二章1.1 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 白细胞的提取 |
| 1.5 流式细胞术检测Sig~+细胞(FACS) |
| 1.6 间接酶联免疫吸附技术(ELISA)检测特异性抗体变化 |
| 1.7 放射免疫(RIA)检测皮质醇含量 |
| 1.8 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 流式结果 |
| 2.2 不同密度下外周血sIg+细胞的变化 |
| 2.3 不同密度下脾脏sIg+细胞的变化 |
| 2.4 不同密度下头肾sIg+细胞的变化 |
| 2.5 不同密度下皮质醇含量变化 |
| 2.6 不同密度下特异性抗体变化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 转录组测序揭示拥挤胁迫对接种疫苗大菱鲆脾脏免疫应答的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用鱼与日常管理同第二章 |
| 1.2 cDNA文库的制备和测序 |
| 1.3 序列组装 |
| 1.4 功能注释 |
| 1.5 差异表达基因 |
| 1.6 RT-qPCR验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA提取质量检测 |
| 2.2 大菱鲆脾脏转录组数据组装 |
| 2.3 转录组数据对比分析 |
| 2.4 物种分布统计 |
| 2.5 转录组数据功能分类 |
| 2.6 差异表达基因筛选与分析 |
| 2.7 对转录组测序Unigenes的验证 |
| 3 讨论 |
| 第五章 转录组测序揭示拥挤胁迫对接种疫苗大菱鲆头肾免疫应答的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用鱼与日常管理同第二章 |
| 1.2 cDNA文库的制备和测序 |
| 1.3 序列组装 |
| 1.4 功能注释 |
| 1.5 差异表达基因 |
| 1.6 RT-qPCR验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 序列质量评估 |
| 2.1.1 测序错误率分布检测 |
| 2.1.2 A/T/C/G含量分布检测 |
| 2.1.3 测序序列均一性分布检测 |
| 2.2 差异表达基因筛选与分析 |
| 2.3 RT-qPCR对转录组测序的验证 |
| 3 讨论 |
| 第六章 大菱虾IL-4/13基因的克隆及拥挤胁迫对其表达量的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 序列的获得与鉴定 |
| 1.2 RNA的提取 |
| 1.3 3'RACE反应 |
| 1.4 5'RACE反应 |
| 1.5 IL-4基因全长序列的验证 |
| 1.6 实时荧光定量PCR |
| 2 结果 |
| 2.1 序列鉴定 |
| 2.2 IL-4/13基因在大菱鲆各组织中的表达 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（10）胞质DNA对细胞还原四氮唑和葡萄糖代谢的影响及其机制探讨（论文提纲范文）
| 缩略语及中英文对照 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 细胞葡萄糖代谢与能量应激反应 |
| 1.1 细胞葡萄糖代谢 |
| 1.2 细胞能量应激反应 |
| 2 四氮唑还原与细胞活力 |
| 2.1 四氮唑 |
| 2.2 四氮唑的还原 |
| 2.3 四氮唑还原的生物学应用 |
| 3 胞质DNA |
| 4 胞质DNA的识别 |
| 5 胞质DNA引起的细胞应答反应 |
| 5.1 胞质DNA引起的细胞固有免疫应答 |
| 5.2 胞质DNA引起细胞固有免疫应答的细胞研究模型 |
| 5.3 胞质DNA诱发细胞固有免疫应答的信号通路 |
| 6 病毒感染与细胞葡萄糖代谢 |
| 7 立题背景与研究假说 |
| 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株、质粒及合成的DNA片段 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 实验材料 |
| 1.5 主要仪器设备及厂家 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞的传代与接种 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 病毒感染 |
| 2.5 MTT实验 |
| 2.6 MTS/WST-1/CCK-8 实验 |
| 2.7 ATP水平检测 |
| 2.8 蛋白质相关实验方法 |
| 2.9 葡萄糖消耗和乳酸产生的生化检测实验 |
| 2.10 细胞计数 |
| 2.11 激光共聚焦 |
| 2.12 实时荧光共聚焦显微镜拍摄活细胞 |
| 2.13 基因敲除细胞株的构建 |
| 2.14 基于病毒载体的外源表达和基因干扰技术 |
| 2.15 胞质DNA刺激实验 |
| 2.16 核质分离实验 |
| 2.17 DNA体外结合实验验证AUF1 是否与DNA相结合 |
| 2.18 AMPK和mTORC1活性检测 |
| 2.19 基于核磁共振的代谢组分析 |
| 2.20 实时荧光定量PCR |
| 2.21 数据分析 |
| 实验结果 |
| 1 胞质DNA抑制细胞代谢活力 |
| 1.1 胞质DNA抑制细胞生长 |
| 1.2 胞质DNA抑制细胞还原四氮唑的能力 |
| 1.3 胞质DNA诱导的细胞代谢应答并不依赖于细胞固有免疫应答 |
| 2 葡萄糖代谢是细胞还原四氮唑所必需的 |
| 2.1 培养基中的葡萄糖是细胞还原四氮唑所必需的 |
| 2.2 葡萄糖短时间饥饿引起的四氮唑还原障碍并非由于细胞死亡 |
| 2.3 抑制葡萄糖代谢可抑制细胞还原四氮唑 |
| 3 胞质DNA抑制细胞葡萄糖代谢并诱发细胞能量应激反应 |
| 3.1 胞质DNA抑制细胞葡萄糖的摄入和乳酸的产生 |
| 3.2 胞质DNA诱导ATP水平下降和AMPK介导的能量应激反应 |
| 4 胞质DNA识别蛋白的初步鉴定 |
| 4.1 AUF1 是胞质DNA结合蛋白 |
| 4.2 AUF1 介导胞质DNA诱发的细胞代谢应答 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 1 细胞内是否存在抗病毒的代谢屏障 |
| 2 AMPK介导的细胞能量应激反应在细胞抗病毒中的作用 |
| 3 胞质DNA诱导细胞代谢应答的分子机制探讨 |
| 4 单链DNA引起的细胞应答反应 |
| 5 葡萄糖代谢中调控细胞还原四氮唑的关键酶 |
| 6 四氮唑还原法在细胞代谢分析中的应用前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、葡萄糖调节蛋白的生物学特性及其在应激免疫应答中的作用（论文参考文献）
- [1]不同免疫状态下鸡miRNA的表达特性及机制研究[D]. 刘洋. 哈尔滨师范大学, 2021(08)
- [2]利用突变技术对HSV2 RL1、UL41和US12蛋白在病毒致病中的生物学机制研究[D]. 牟唐维. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]刺参应对高温低氧胁迫的生理响应与分子调控特征[D]. 霍达. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2020(01)
- [4]三种大豆蛋白源致珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Elanceolatus♂）肠道黏膜屏障损伤的差异机制研究[D]. 张卫. 广东海洋大学, 2020
- [5]壳寡糖免疫增强及对肾癌抑制作用的研究[D]. 翟星辰. 哈尔滨工业大学, 2019(01)
- [6]miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究[D]. 余新刚. 华南农业大学, 2019
- [7]日本囊对虾高温胁迫响应机制研究[D]. 郑锦滨. 厦门大学, 2019(08)
- [8]基于转录组学和代谢组学研究三丁基氯化锡对暗纹东方鲀幼鱼的毒理学机制[D]. 徐东坡. 安徽师范大学, 2018(01)
- [9]拥挤胁迫对大菱鲆接种迟钝爱德华氏菌减毒活疫苗免疫应答的影响[D]. 霍欢欢. 南京农业大学, 2017(07)
- [10]胞质DNA对细胞还原四氮唑和葡萄糖代谢的影响及其机制探讨[D]. 谢琳娜. 福建医科大学, 2017(04)