一、CD34基因与血管内皮细胞（论文文献综述）
陈静[1]（2021）在《MAPK4通过调节内皮细胞增殖促进非小细胞肺癌体内生长的研究》文中研究表明目的:研究MAPK4对NSCLC肿瘤生长的调控作用及机制方法:1.C57BL/6野生型小鼠（Wild type,WT）与C57BL/6 MAPK4（Mitogen Activated Protein Kinase 4,MAPK4）基因敲除小鼠（MAPK4 KO）分成两组,小鼠非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）LLC/KLN205细胞以5×105个/只常规构建小鼠NSCLC肿瘤模型;每隔两天动态记录肿瘤生长情况;于第14天处死小鼠,并取出肿瘤、肺脏、脾脏,记录肿瘤与肺脏组织的相关体积重量指数;利用H&E染色观察小鼠肺脏病理学变化。免疫荧光技术（Immunofluorescence,IF）分析小鼠肿瘤组织中新生血管标记分子CD34表达、CD34与MAPK4的共定位情况及细胞增殖标记分子Ki67的表达;流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测小鼠脾脏组织中免疫细胞的比例和功能变化;H&E染色观察小鼠肿瘤组织病理学变化。2.MAPK4 KO小鼠腹腔注射抗CD3抗体（250ug/只）,每隔48小时注射一次,第三次注射后24小时,利用FCM检测小鼠外周血中T细胞比例变化;第7天以LLC细胞5×105个/只常规构建小鼠NSCLC肿瘤模型;于荷瘤后第14天处死小鼠并取出肿瘤;记录肿瘤的体积重量指数;H&E染色观察小鼠肿瘤病理学变化。3.构建CD34启动子调控MAPK4 RNAi真核表达载体（PGL3.0 basic-CD34promoter-MAPK4 RNAi）;利用LLC细胞5×105个/只右腋皮下荷瘤WT小鼠,建立小鼠NSCLC肿瘤模型,7天后在肿瘤远端左腋下体内转染载体。每隔两天记录肿瘤生长情况,于第14天处死小鼠取出肿瘤,并记录其体积重量指数;利用H&E染色观察小鼠肿瘤组织病理学变化;IF检测小鼠肿瘤组织中CD34与Ki67的表达;Real-Time PCR检测载体在各个组织的分布及MAPK4在各个组织中的下调水平;记录各个脏器的重量指数。4.利用LLC细胞5×105个/只右腋皮下荷瘤WT小鼠,分别建立1周、2周和3周小鼠NSCLC肿瘤模型,于第7、14、21天观察肿瘤大小,计算肿瘤体积和重量;利用H&E染色观察肿瘤的病理变化;IF检测小鼠肿瘤组织中MAPK4、MAPK6、MAPK15以及NLK的表达。5.利用RNA干扰技术,合成MAPK4 RNAi干扰序列体外瞬时转染入人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC）;48h后利用Real-Time PCR、免疫印迹（Western Blot,WB）及IF检测转染前后MAPK4的表达;CCK8技术检测转染后24h、48h、72h的细胞增殖情况;克隆形成实验检测细胞克隆能力;成管实验检测细胞成管能力;划痕法检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞周期的改变;Real-Time PCR检测细胞周期蛋白CDK1、CDK2的表达;WB检测周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1、p21的表达;RNA测序检测细胞中功能基因表达变化;WB检测相关信号分子ERK、p-ERK、AKT、p-AKT、NFκB、p-NFκB、JNK、p-JNK、MEK、p-MEK、Raf、p-Raf和RAS的表达;细胞计数法检测用p-ERK1/2抑制剂（Cucurbitacin IIb）后细胞的数量变化;CCK8法检测用p-ERK1/2抑制剂后细胞增殖能力的变化;成管实验检测用p-ERK1/2抑制剂后细胞成管能力的改变。6.IF检测人NSCLC组织芯片中MAPK4在癌组织和癌旁组织的表达,并分析MAPK4与CD34在肿瘤中的共定位情况,癌组织和癌旁组织中MAPK4与CD34双阳性细胞数量以及二者的相关性;根据MAPK4/CD34表达量进行免疫组织化学评分（H-Score）,并分为MAPK4low/CD34low组,MAPK4high/CD34low组,MAPK4low/CD34high组和MAPK4high/CD34high组,最后通过Kaplan-Meier法分析四组患者的5年生存率。结果:1.结果显示:与WT小鼠相比,MAPK4 KO小鼠肿瘤生长较慢、体积较小、重量较轻（P<0.05）;两组小鼠肺脏体积无明显差异（P>0.05）;MAPK4 KO小鼠肺部微转移减轻,（P<0.05）;IF结果表明,MAPK4 KO小鼠肿瘤局部CD34分子表达明显减少,并且在肿瘤细胞中CD34与MAPK4有良好的共定位情况;肿瘤组织Ki67的表达显着低于WT小鼠（P<0.05）;两组小鼠脾脏细胞总数无明显差异（P>0.05）;FACS数据显示:MAPK4 KO小鼠脾脏中CD8+T细胞比例高于WT小鼠（P<0.05）;CD4+T细胞、γδT细胞和巨噬细胞等免疫细胞的比例无明显差异（P>0.05）。H&E染色结果表明MAPK4 KO小鼠肿瘤局部血管生成减少（P<0.05）。2.结果显示:注射抗CD3抗体后小鼠外周血中T细胞数量明显减少（P<0.05）;两组小鼠肿瘤体积、重量均无明显差异（P>0.05）;H&E结果进一步提示,两组小鼠肿瘤组织局部新生血管密度无明显差异（P>0.05）。3.双酶切实验与测序结果显示:成功构建PGL3.0 basic-CD34promoter-MAPK4 RNAi真核表达载体（命名为:p-si MAPK4）;与对照载体（命名为:p-cont）组相比,p-si MAPK4组小鼠肿瘤生长较较慢、体积较小、重量较轻（P<0.05）;H&E染色结果表明p-si MAPK4转染组小鼠肿瘤组织局部血管生成明显减少（P<0.05）;IF结果进一步表明:p-si MAPK4转染组小鼠肿瘤组织局部CD34分子表达明显减少,且Ki67的表达显着低于对照p-cont组小鼠（P<0.05）;进一步数据显示:此载体能够靶向到血管丰富的组织中,并能有效下调肿瘤组织中MAPK4的表达;最后两组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾、大脑、结肠的重量无明显改变（P>0.05）。4.结果显示:肿瘤体积和重量随时间显着增加（P<0.05）;另外,随着时间的推移,模型建立1周后肿瘤组织中血管密度明显增加（P<0.05）;IF结果进一步显示,与其他三个非典型MAPK家族成员MAPK6、MAPK15和NLK相比,MAPK4在肿瘤组织中高表达,且MAPK4在肿瘤中的表达增加伴随着血管生成的增加（P<0.05）。5.Real-Time PCR结果显示:MAPK4 RNAi在体外瞬时转染入HUVEC细胞后第48h,MAPK4 RNAi组细胞中MAPK4的m RNA水平明显低于NC组（P<0.05）;WB和IF结果表明MAPK4 RNAi组细胞中MAPK4蛋白表达降低（P<0.05）;CCK8结果显示:MAPK4 RNAi组细胞增殖水平明显低于NC组,并在48h时差异最大（P<0.05）;克隆形成结果表明:MAPK4 RNAi组细胞的集落形成能力明显下降（P<0.05）;并且成管实验结果表明:MAPK4 RNAi组内皮细胞的成管能力明显下降（P<0.05）;划痕实验结果显示内皮细胞体外迁移能力并未改变（P>0.05）;FCM结果进一步表明MAPK4 RNAi组细胞周期中G0/G1期比例明显下降（P<0.05）,S期比例上升（P<0.05）,G2/M期比例无显着性差异（P>0.05）;并且Real-Time PCR结果提示MAPK4 RNAi组细胞中CDK1、CDK2的m RNA水平明显低于NC组（P<0.05）;同样的,WB结果显示MAPK4 RNAi组细胞中Cyclin A和凋亡蛋白p21的表达水平均低于NC组（P<0.05）,而Cyclin B1的表达水平无明显变化（P>0.05）。6.RNA测序结果显示:相比于NC组细胞,MAPK4 RNAi组细胞共有542个基因被上调,608个基因被下调;GO分析结果表明:MAPK4 RNAi组细胞中MAP激酶相关基因、Th1和树突状细胞分化相关基因明显下调（P<0.05）,细胞周期和DNA复制有关基因被明显上调（P<0.05）;KEGG分析结果显示:MAPK4 RNAi组细胞中自然杀伤细胞介导的细胞毒性途径、趋化因子信号通路、TOLL样受体信号通路（P<0.05）。7.WB结果显示:MAPK4 RNAi组细胞内p-ERK1/2蛋白水平明显增加（P<0.05）,而ERK、AKT、p-AKT、NFκB、p-NFκB、JNK、p-JNK蛋白水平无显着差异（P>0.05）;并且WB结果进一步显示ERK上游分子p-MEK、Raf、p-Raf蛋白水平均显着升高（P<0.05）。随后对MAPK4 RNAi组细胞给药p-ERK抑制剂,IF结果显示:MAPK4 RNAi组细胞p-ERK1/2的表达明显降低（P<0.05）。细胞计数结果显示p-ERK1/2表达降低后细胞数量明显增多（P<0.05）,CCK8实验结果表明p-ERK1/2表达降低后内皮细胞的细胞增殖能力明显增强（P<0.05）,进一步成管实验结果显示:p-ERK1/2表达降低后内皮细胞的成管能力得到改善（P<0.05）。8.人NSCLC组织芯片结果显示:MAPK4在癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P<0.05）,且二者在肿瘤细胞中有较好的共定位,癌组织中CD34与MAPK4双阳性细胞数量高于癌旁组织中双阳性细胞数量（P<0.05）,并且癌组织中MAPK4与CD34的表达有线性相关性（相关系数r=0.5994）;根据MAPK4和CD34的H-Score评分,将NSCLC患者分为MAPK4low/CD34low组,MAPK4high/CD34low组,MAPK4low/CD34high组和MAPK4high/CD34high组,进一步分析表明MAPK4high/CD34high组患者5年生存率明显降低（P<0.05）。结论:1.MAPK4通过调控肿瘤血管生成促进NSCLC肿瘤生长。2.MAPK4通过激活Raf/MEK/ERK1/2通路调控内皮细胞增殖。3.MAPK4high/CD34high与临床非小细胞肺癌患者预后不良相关。
杨青[2]（2021）在《从血管新生方向探讨miR-221-3p对心肌梗死保护作用的机制研究》文中研究表明目的:通过建立心肌梗死大鼠模型,观察miR-221-3p在心肌梗死大鼠心肌组织的表达情况和miR-221-3p在心肌梗死急性期心肌组织表达的细胞类型;诱导HCMEC缺氧,观察不同缺氧时间对HCMEC miR-221-3p表达水平的影响;探讨miR-221-3p在心肌缺血时对HCMEC血管新生的调控及机制。方法:1、建立心肌梗死大鼠模型,将大鼠分为心肌梗死急性期组（心肌梗死后12h处死大鼠）和心肌梗死慢性期组（心肌梗死后4周处死大鼠）。qPCR检测大鼠心肌组织miR-221-3p的表达水平,免疫荧光共染色观察miR-221-3p在心肌梗死急性期心肌组织中表达的细胞类型。2、诱导HCMEC缺氧1h、2h、4h、8h、12h、24h,qPCR检测各时间点miR-221-3p的表达水平。转染miR-221-3p模拟物和抑制剂,分为5组:（1）空白对照组;（2）mimic组;（3）mimic NC组（4）inhibitor组;（5）inhibitor NC组,各组均在转染后缺氧4小时。采用Ang-2质粒过表达Ang-2蛋白。qPCR、W estern-blot检测Ang-2、CD34、IGF1R、IGF2、VEGFR2 m RNA及蛋白的表达,CCK-8检测细胞增殖,成管实验检测HCMEC在体外的成管能力。结果:1、qPCR结果显示:与对照组比较,大鼠心肌梗死后12h心肌组织中miR-221-3p的表达水平明显升高（P（27）0.01）;与非梗死区比较,梗死周边区心肌组织中miR-221-3p上调（P（27）0.01）;与对照组比较,心肌梗死4周时梗死组心肌组织中miR-221-3p的表达水平降低（P（27）0.05）。2、免疫荧光共染色结果显示:在大鼠心肌梗死急性期miR-221-3p在心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中都有表达。3、qPCR结果显示,HCMEC缺氧4小时miR-221-3p表达水平升高,与对照组比较,差异有统计学意义（P（27）0.05）。4、CCK-8实验结果显示:在缺氧条件下miR-221-3p mimic组OD值在12～72h均较对照组低,差异有统计学意义（其中72h P（27）0.05,其余时间点P<0.01）。在缺氧条件下miR-221-3p inhibitor组OD值在12～72h均较对照组高,差异有统计学意义（P<0.01）。5、细胞成管实验结果显示:在缺氧条件下过表达miR-221-3p导致HCMEC管腔形成数减少,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。在缺氧条件下转染miR-221-3p抑制剂后导致HCMEC管腔形成数增多,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。6、Western-blot结果显示:缺氧条件下过表达miR-221-3p可致HCMEC CD34、IGF1R、IGF2、VEGFR2、Ang-2蛋白表达水平减少,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。缺氧条件下转染miR-221-3p抑制剂后HCMEC CD34、IGF1R、IGF2、VEGFR2、Ang-2蛋白表达水平升高,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。7、qPCR及Western-blot结果显示,缺氧条件下过表达Ang-2导致HCMEC CD34、IGF1R、IGF-2、VEGFR2 m RNA和蛋白的表达水平升高,与对照组及mimic NC组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论:1、大鼠心肌梗死急性期心肌组织miR-221-3p表达水平升高,心肌梗死慢性期心肌组织miR-221-3p表达水平降低。在大鼠心肌梗死急性期miR-221-3p在心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中都有表达。2、缺氧条件下miR-221-3p可能靶向Ang-2抑制心脏微血管内皮细胞向尖端细胞转化。3、心肌梗死急性期miR-221-3p的上调对心肌梗死是有保护作用的,其机制可能是miR-221-3p靶向Ang-2抑制心肌梗死后的异常血管新生,从而减轻血管渗漏和微血管灌注不足。
浦延鹏[3]（2021）在《基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制》文中认为目的:探索眼针对MCAO/R大鼠神经功能缺损的保护作用机制。观察眼针干预后,对MCAO/R大鼠脑组织尼氏体和血管新生的影响,探究眼针能否通过促进尼氏体恢复,促进血管新生,增加Wnt3a、β-catenin、LEF1及HIF-1α因子的表达,以减轻脑损伤,加快神经功能的恢复,希望能够通过此研究为临床眼针治疗缺血性脑卒中提供可靠的研究依据。材料与方法:1动物及分组选用SPF级健康雄性成年SD大鼠,采用随机数字表法将大鼠分为空白组（blank）、假手术组（sham）、模型组（model）、眼针组（eye acupuncture）、针刺组（acupuncture）,每组12只,遵照《关于善待实验动物的指导性意见》（科技部2006年颁布）中动物的使用及伦理学规定。2模型制备方法采用改良线栓法制备大鼠MCAO/R模型,具体方法见正文。3干预方法空白组,不进行干预;假手术组,在行手术后,不再做其他干预措施;模型组,造模成功后,不再做其他干预措施。针刺组,造模成功后,用13mm的毫针,分别取大鼠的百会穴和曲鬓穴,平刺,进针大约3mm,透过真皮达皮下组织,然后开始计时,在10min时和20min时,各刮针柄5下,共留针20min;眼针组,在造模成功后,选取双侧上焦区、下焦区、肝区和肾区进行眼针针刺治疗,主要采用平刺法,深度透过真皮,留针20min。两组针刺皆在脑缺血再灌注一小时后开始,每隔8h针刺一次,在各时间节点前30min,行最后一次针刺治疗,对3h,24h及72h三个时间节点进行评测,取材检测。4指标检测及方法造模前、后及治疗前、后,观察大鼠的一般情况,应用Longa评分法、Bederson评分法及前肢踩空试验三种方法,对大鼠的神经功能进行评测,应用TTC染色法观察大鼠脑梗死的情况,采用尼氏体染色的方法观察大鼠脑组织神经元的变化情况;通过免疫组织化学观察缺血区大脑皮层CD34+的阳性表达变化,另采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中VEGFA的表达变化;应用免疫组织化学法和Western blot两种方法,检测大鼠脑组织缺血半暗带区域中HIF-1α因子,及Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路相关因子的表达水平。5统计学分析采用SPSS25.0进行统计分析,以均数加减标准差为统计量（x±s）,采用单因素方差分析（One-Way-Anova）进行总体比较,有差异的采用最小显着差异法（LSD）进行两两比较,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1 TTC染色法评价大鼠脑梗死结果显示,空白和假手术组的脑组织呈红色,无明显梗死灶,而模型组则有明显的苍白色梗死灶。2大鼠神经功能障碍评分Longa评分和Bederson评分结果显示,与空白和假手术组比较,模型组大鼠的评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分明显降低（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组评分降低（P<0.05）,差异具有统计学意义;而空白与假手术组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3大鼠前肢踩空试验评分变化在3h和24h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分改变不明显（P>0.05）,差异无统计学意义;而在72h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分明显降低（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组评分降低（P<0.05）,差异具有统计学意义。4大鼠尼氏体染色结果尼氏体染色结果显示,在3h和24h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组尼氏体明显减少（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的尼氏体明显增多（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组尼氏体增加较多（P<0.05）,差异具有统计学意义;而在72h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组尼氏体明显减少（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的尼氏体明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而空白和假手术组,眼针组和针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。5免疫组织化学法检测大鼠脑组织CD34+的表达在3h时,各组之间CD34+的表达无明显差异（P>0.05）;而在24h和72h时,与空白和假手术组比较,模型组CD34+的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组CD34+的表达明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;空白组与假手术组,眼针组与针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。6酶联免疫吸附法检测大鼠血清中VEGFA的表达与空白和假手术组比较,模型组大鼠血清VEGFA的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组VEGFA的表达明显增多（P<0.05）,且在24h时,眼针组与针刺组比较,眼针组的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义;空白组与假手术组比较,3h和72h时眼针组与针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。7 Western blot法检测大鼠脑组织缺血半暗带区域相关因子的表达与空白和假手术组比较,模型组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达也明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;眼针组与针刺组比较,在3h时,β-catenin,LEF1的表达明显较多,Wnt3a的表达较低（P<0.05）,而HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在24h时,Wnt3a,β-catenin的表达明显较多（P<0.05）,而LEF1和HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在72h时,Wnt3a,HIF-1α的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而β-catenin和LEF1的表达无明显差异（P>0.05）。8免疫组织化学法检测大鼠脑组织相关因子的表达与空白和假手术组比较,模型组大鼠脑组织Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达也明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;眼针组与针刺组比较,在3h时,Wnt3a,β-catenin,LEF1及HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在24h时,β-catenin及HIF-1α的表达明显较多（P<0.05）,Wnt3a及LEF1的表达差异无统计学意义（P>0.05）;在72h时,Wnt3a的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而β-catenin,LEF1和HIF-1α的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.眼针可以改善MCAO/R大鼠的神经功能缺损,其机制可能是通过改善神经元的损伤,从而促进神经功能的恢复,且疗效好于针刺组。2.眼针可以促进MCAO/R大鼠血清VEGFA的增多,从而促进血管新生,改善脑损伤。3.眼针可以增加MCAO/R大鼠HIF-1α因子及经典Wnt信号传导通路中Wnt3a,β-catenin,LEF1的表达,从而促进血管新生,减轻神经元损伤,促进神经功能的恢复,这可能是眼针治疗缺血性脑卒中的作用机制之一。
张蒙[4]（2021）在《VEGFR2/mTOR/S6K1通路在洛克沙胂促血管生成中的作用》文中研究表明洛克沙胂（Roxarsone,Rox）是一种有机砷化合物,具有抗球虫、促进动物生长等作用,目前仍在许多发展中国家作为饲料添加剂使用。洛克沙胂吸收率较低,大多随粪便排出体外,可通过环境及动物性食品途径增加人砷暴露的风险。现有研究发现Rox在体内体外具有促进血管生成的作用。本实验室前期研究表明Rox可通过血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）信号,促进血管或肿瘤血管生长。本文拟通过体外血管内皮细胞培养,体内基质胶塞模型及小鼠B16细胞移植瘤模型,采用特异性信号抑制剂或RNA干扰技术,研究VEGFR2/mTOR/S6K1信号在洛克沙胂促血管生成中的作用,为Rox促血管生成的作用机制研究积累资料。在大鼠血管内皮细胞体外培养中,不同处理分组如下:对照组（PBS）、0.1μmol/L、1.0μmol/L和10.0μmol/LRox处理组、雷帕霉素处理组（25 nmol/L）、Rox+雷帕霉素共处理组（1.0μmol/L+25 nmol/L）、SU5416处理组（0.2μmol/L）、Rox+SU5416处理组（1.0μmol/L+0.2μmol/L）、10ng/mLVEGF阳性组、VEGF+SU5416共处理组。采用MTT法检测细胞活性、EdU法检测细胞增殖、划痕试验检测细胞迁移能力、管形成试验检测血管样结构的生成,Western Blot及荧光定量PCR检测细胞中VEGFR、mTOR/S6K1等相关蛋白的表达。结果表明1.0μmol/LRox能够显着提高血管内皮细胞的活性、增殖、迁移和管形成能力,上调mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、VEGF和VEGFR2蛋白表达,显着提高mTOR和S6K1 mRNA表达。雷帕霉素能够显着抑制Rox对内皮细胞的活性、增殖、迁移和管形成的促进作用,显着降低p-mTOR、p-S6K1和VEGF蛋白表达。SU5416能够降低Rox对内皮细胞的增殖、迁移和管形成的能力的促进作用,显着降低Rox对细胞中p-mTOR和p-S6K1蛋白表达的促进作用。在小鼠B16移植瘤模型研究中,小鼠腋下注射B16黑色素瘤细胞构建移植瘤模型。见瘤后荷瘤鼠不同处理分组如下:对照组（PBS）、25mg/kg Rox灌胃处理组、SU5416注射处理组（10mg/kg）、Rox+SU5416共处理组（25mg/kg+10mg/kg）。试验期间测量小鼠体重、肿瘤体积。至注射B16细胞14d后,剥离肿瘤并称重;肿瘤切片进行HE染色和CD34免疫组化分析,并检测肿瘤组织中mTOR/S6K1通路相关蛋白表达。结果表明Rox处理组肿瘤的体积和重量,及肿瘤组织中血管生成显着增加;mTOR、S6K1及其磷酸化蛋白,以及VEGF的蛋白水平和mRNA水平均显着上调。VEGFR2拮抗剂SU5416能够显着降低Rox对肿瘤生长和瘤内血管生成的促进作用。在小鼠基质胶塞模型研究中,利用已经建立的靶向重组慢病毒RNA干扰大鼠血管内皮细胞中VEGFR2的表达。将不同处理后的血管内皮细胞注入小鼠皮下,形成胶塞,检测基质胶塞的体积和重量;HE染色和CD34免疫组化分析胶塞中血管的生成。血管内皮细胞的不同处理如下:对照组（PBS）、1.0μmol/LRox处理组、RNAi干扰组、Rox+RNAi共处理组、NC组。结果表明,Rox显着增加胶塞的体积和重量,促进基质胶中血管的生成。SU5416能够显着降低Rox对基质胶塞中血管生成的促进作用。综上所述,Rox在体外能够促进大鼠血管内皮细胞的生长、迁移和管样结构的形成;抑制VEGFR2或mTOR信号,能够显着抑制Rox对内皮细胞生长的促进作用。Rox在体内能够促进移植瘤和基质胶塞的生长及其血管生成,抑制VEGFR2能够显着降低Rox对肿瘤生长的促进作用;靶向VEGFR2 RNA干扰,能够抑制Rox对基质胶塞中血管生成的促进作用。VEGFR2/mTOR/S6K1通路在Rox体内体外促血管生成中发挥着重要的调节作用。
宫文静[5]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中研究说明研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。
贺健[6]（2021）在《单细胞转录组解析人类胚胎造血干细胞与巨核细胞的发育》文中认为哺乳动物血液系统为中胚层起源,在发育早期具有多位点起始、多谱系层级等特征。解析血液发生过程的细胞命运和分子机制对再生医学意义重大。造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）是个体血液系统形成的基础,并且通过自我更新（Self-renewal）和多系分化（Multilineage differentiation）维持个体整个生命周期的血液系统功能。一般认为,胚胎时期的造血干细胞起源于主动脉-性腺-中肾区域（Aorta-gonad-mesonephros,AGM）的背主动脉（Dorsal aorta）腹侧,由一群具有生血潜能的内皮细胞（Hemogenic endothelial cell,HEC）经内皮生血转化（Endothelial to hematopoietic transition,EHT）发育而来。目前关于造血干细胞起源的认识大部分都是基于小鼠,斑马鱼等模式动物的研究。由于早期人胚样本较难获得,以及细胞数量相对较少,人们对于人胚造血干细胞的发生过程仍然知之甚少,尤其是关于HSC前体细胞HEC的特征及其富集策略,亟待通过高效的方法和手段加以解析。本研究中,我们首先对胚胎背主动脉的细胞进行基于10x Genomics平台的单细胞转录组测序（sc RNA-seq）,分析鉴定出一群特异性高表达RUNX1的内皮细胞,功能富集分析该群体具有明显的RNA合成和代谢活跃等特征;通过对差异基因中表面标志分子的筛选,我们推测CD44具有在内皮细胞中富集生血内皮细胞的潜能。随后,我们对背主动脉区域的内皮细胞中CD44+和CD44-的群体进行富集测序（Single cell tagged reverse transcription sequencing,STRT-Seq）,发现CD44+主要富集了动脉内皮细胞,而CD44-主要富集了静脉内皮细胞,并且在动脉内皮细胞中分离出一群表达RUNX1,MYB和ANGPT1的生血内皮细胞,功能富集分析显示这群生血内皮细胞同样表现出显着的核糖体代谢等特征。随后,我们使用STRT-Seq对背主动脉中的CD34+CD45+的造血干祖细胞（HSPC）进行了测序,分析鉴定出一个淋系祖细胞和一个髓系祖细胞亚群,以及三个分别表现为明显动脉特征、细胞周期活跃以及相对成熟的造血干祖细胞亚群。联合所有的内皮细胞和造血干祖细胞群体,我们构建了胚胎背主动脉区内皮生血转化过程中细胞特化的路径,并发现一些基因,如EMCN,PROCR和RUNX1T1会在内皮向造血命运决定的时刻呈现瞬时上调表达的趋势。通过对极早期胚胎体进行测序分析,我们发现了一群同样兼具内皮和生血特征的早期生血内皮细胞。相比于背主动脉生血内皮细胞,早期生血内皮细胞缺乏动脉特征和Notch信号的富集。联合所有的内皮造血细胞进行分析,我们推测早期生血内皮细胞不需要经历类似于背主动脉生血内皮细胞的动脉化过程,而直接分化产生造血细胞。最后,利用配-受体对分析,我们解析了背主动脉区域不同间质,上皮和内皮细胞群体与生血内皮细胞的潜在互作关系,并提示了Notch,BMP4,TGF-beta等信号通路在生血微环境形成过程中潜在的调控作用。同样,我们利用sc RNA-seq解析了人胚发育过程中卵黄囊和胎肝中细胞异质性,明确了其中巨核细胞的转录组特征。通过比较分析,我们发现卵黄囊中的巨核细胞主要呈现糖酵解等特征,而胎肝中的巨核细胞主要呈现周期活跃等特征。进一步地,我们整合并分析了巨核细胞自身的异质性,发现其除了产生血小板的常规巨核细胞亚群,还包含了一群胞外基质特征明显的微环境形成巨核细胞,和一群CD14+免疫调节特性的巨核细胞。通过假时序分析,我们发现这些不同的巨核细胞亚群呈现两种分化模式并且具有不同的转录调控机制。总的来说,我们围绕造血干细胞发生过程和巨核细胞异质性,利用单细胞转录组测序解析了人胚早期造血系统发育的分子细胞图谱。我们首先在背主动脉区域捕获到一群兼具动脉内皮特征和生血特征的造血干细胞;进一步的筛选发现CD44是能够高效富集生血内皮的表面标志分子;随后我们又解析了背主动脉区域造血干祖细胞的异质性,并联合动脉内皮细胞和生血内皮细胞,绘制了内皮生血转化的细胞发育路径和探究了该过程中的分子变化规律;此外,我们在极早期的胚内发现了一群缺乏动脉内皮特征的早期生血内皮细胞;并且通过分析背主动脉区不同细胞群体与生血内皮细胞的互作,在分子水平上阐释了生血微环境异质性;最后,我们解析了巨核细胞的发育位点差异和群体的异质性,及其分化过程的调控模式。这些发现不仅填补了人胚早期血液系统发生过程的知识空缺,同时也为血液相关疾病的治疗尤其是体外血液再生策略提供重要理论基础。
薛巍[7]（2020）在《高级别脑胶质瘤新生血管基因特征及生成方式与MR灌注成像相关性研究》文中提出背景及目的:脑胶质瘤（Glioma）是成人颅内最常见的原发性肿瘤,占成人颅内原发性恶性肿瘤的百分之七十以上,世界卫生组织（World health organization,WHO）根据其细胞异型性、核分裂活跃程度、微血管增生和坏死程度将其分为Ⅰ到Ⅳ级,Ⅰ级和Ⅱ级胶质瘤为低级别胶质瘤（Low-grade glioma,LGG）,Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤为高级别胶质瘤（High-grade glioma,HGG）。高级别胶质瘤恶性程度高,肿瘤进展快,即使治疗方法不断发展,其预后仍然很不理想,特别是WHOⅣ级胶质母细胞瘤,中位生存时间仅为14.6个月,5年生存率低于5%。高级别胶质瘤血管增生活跃,基底膜畸形、内皮不完整、周细胞缺失以及连通紊乱,形成了低氧、酸性以及高细胞间压力的特殊肿瘤微环境,刺激缺氧诱导因子（Hypoxia-Inducible factor,HIF）、促血管生成因子如血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）等的分泌而进一步促进肿瘤血管新生,而且与肿瘤的生长、进展及转移密切相关。胶质瘤微血管还参与形成肿瘤血管龛（Niche）样结构,既可以为胶质瘤肿瘤干细胞的生存提供必要的场所及营养支持,又可以通过血管内皮细胞与肿瘤干细胞的相互交联促进干细胞的自我更新与干性维持,在胶质瘤的治疗抵抗以及复发中发挥关键作用。高级别胶质瘤的微血管增生在肿瘤生物学行为中发挥重要作用,抗血管治疗为胶质瘤的治疗提供了新的思路和方向。胶质瘤的血管新生是一个多基因、多分子调控的复杂过程。多种细胞因子参与其中,例如VEGF、基质细胞衍生因子1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α）、血管生成素（Angiopoietin-2,ANG-2）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）、HIF以及基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMP）等,均在肿瘤发生发展的不同阶段以及不同的病理性血管生成过程中发挥促血管新生的作用。高级别胶质瘤内存在多种形式的血管新生方式,如血管共生、血管生成、血管发生、血管拟态和肿瘤细胞内皮转分化等,不同的血管新生方式对应的病理过程以及调控机制不同,其主要调控基因既有交叉又相互独立。其中VEGF基因的高表达是胶质瘤中促进肿瘤血管新生的关键事件,参与了多种方式的血管新生,但是临床上使用放疗联合替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）化疗辅以贝伐单抗（Bevacizumab,BEV）抑制肿瘤VEGF生物活性的抗血管治疗策略并未能延长胶质瘤患者的生存时间,甚至在BEV治疗之后肿瘤区域血管共生增多且肿瘤侵袭增强,而且针对其它促血管新生分子的抗血管治疗策略在临床上也没能真正起到抗肿瘤血管新生进而抑制肿瘤生长的目的。说明尚有未知的血管新生调控基因以及抗血管治疗后血管新生方式的变化导致了胶质瘤的抗血管治疗未能达到预期的目的。由于高级别胶质瘤具有明显的异质性,手术或活检获取的部分肿瘤组织无法全面反映肿瘤的生物学特性,因此在抗血管治疗过程中尚待寻找一种能全面评价肿瘤内部血管相关基因表达以及无创监测抗血管治疗疗效的有效手段。磁共振灌注成像（Perfusion-weighted MR imaging,PWI-MRI）技术被广泛应用于无创监测肿瘤内部血流及血管情况,进而评估肿瘤的分子特征及基因表达。DSC-MRI成像技术根据血管内对比剂信号强度随时间的变化,可以获得反映肿瘤内部血流灌注的参数CBV及CBF,DCE-MRI成像技术不仅可以获取肿瘤内部血流灌注的信息,例如血浆容积Vp、血管外细胞外间隙容积Ve,而且可以获得反映肿瘤血管功能的参数,例如血管通透性指标Ktrans以及对比剂反流速率指标Kep。这些参数不仅与肿瘤区域血管的结构和功能相关,而且在一定程度上可以反映肿瘤的分子特征及基因表达。例如,Ktrans与胶质母细胞瘤DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）启动子甲基化状态相关,rCBV可以用来评估胶质瘤患者异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase,IDH）突变状态及MGMT启动子甲基化状态等,也有文献报道肿瘤特定信使核糖核酸（Messenger RNA,m RNA）的表达量与其磁共振成像特征相关。因此磁共振灌注成像技术可以作为无创评价肿瘤内部血管相关基因表达以及抗血管治疗后肿瘤血管新生方式变化的潜在手段。综上所述,本研究首先收集了高级别胶质瘤手术标本,提取原代肿瘤细胞建立原位小鼠肿瘤模型并对肿瘤组织进行转录组测序,根据肿瘤标本微血管状态以及能否成功构建原位胶质瘤模型,筛选出新的与高级别胶质瘤早期生长与进展密切相关的血管新生相关基因,并且筛选影像生物指标预测相关基因的表达情况,为胶质瘤抗血管治疗提供新的靶点以及检测手段。而后对比了原代小鼠原位胶质瘤模型与患者脑胶质瘤常规及灌注磁共振特征的差异,并且从组织病理学以及基因表达的角度探究造成这些差异的原因,为动物来源的磁共振生物标志的临床应用提供实验基础,最后通过BEV和TMZ单独或联合干预原位小鼠胶质瘤模型的生长,探究治疗过程中肿瘤血管新生方式的动态变化以及能反映这种变化的影像标志,从血管新生方式的角度探索抗血管治疗失败的原因,为胶质瘤的个体化精准诊断以及抗血管治疗疗效监测提供科学可靠的实验依据。材料与方法:第一部分:高级别脑胶质瘤生长早期血管新生相关基因表达与PWI-MRI监测1、收集高级别胶质瘤病例30例,术前行DSC及DCE-MRI扫描,术中取肿瘤标本。2、无菌条件下将肿瘤标本分为三部分,第一部分用来提取原代肿瘤细胞建立小鼠原位肿瘤模型;第二部用来对肿瘤血管进行组织病理学分析,定量分析肿瘤区域微血管密度（Microvessel density,MVD）,微血管面积（Microvascular area,MVA）以及平均微血管直径（Diameter）;第三部分用来进行转录组测序。3、对DSC及DCE-MRI原始图像进行后处理后获得CBV、CBF、Ktrans、Vp、Ve及Kepmap,计算肿瘤所有体素平均r CBV、r CBF、Ktrans、Vp、Ve及Kep值作为该肿瘤的r CBV、r CBF、Ktrans、Vp、Ve及Kep值。4、根据原代肿瘤细胞能否在小鼠颅内生长并建立原位移植瘤模型,将30例高级别胶质瘤病例分为成瘤组与未成瘤组,比较两组病例灌注磁共振扫描参数r CBV、r CBF、Ktrans、Vp、Ve和Kep,肿瘤组织MVD、MVA和微血管直径,以及血管新生相关基因表达的差异。5、使用siRNA分别抑制两例原代肿瘤细胞内上述基因的表达,检测其成血管能力的变化。6、根据小鼠原位移植瘤生长曲线,动态监测上述基因在肿瘤不同生长阶段的表达及其与肿瘤微血管的关系。7、对两组病例之间有显着差异的磁共振扫描参数进行受试者操作特性曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）评估,获取其鉴定肿瘤组织上述基因是否高表达的诊断阈值（cut-off值）、特异性及敏感性。第二部分:原代脑胶质瘤模型与相应患者脑胶质瘤MRI特征及基因表达差异研究1、收集了高级别胶质瘤病例7例。术前均行常规MRI,DWI-MRI以及DCE-MRI扫描,术中取肿瘤标本。2、对患者DWI及DCE-MRI原始图像进行后处理后获得ADC及Ktransmap,使用热点法在肿瘤最大层面上选取五个感兴趣区（Region of interest,ROI）,分别测量得到r ADC及Ktrans值,计算平均值作为该病例肿瘤的r ADC及Ktrans值。3、分别提取原代肿瘤干细胞球并建立相应NOD-SCID小鼠原位胶质瘤模型,每例建模5只。4、在NOD-SCID小鼠原位移植瘤生长晚期,采用Bruker 7.0T小动物磁共振成像仪头部线圈对荷瘤鼠进行扫描,扫描序列有T1WI横断位,T2WI冠状位,T1WI增强扫描,DWI及DEC-MRI。5、对小鼠移植瘤DWI及DCE-MRI原始图像进行后处理后获得ADC及Ktransmap,使用热点法在肿瘤最大层面上分别选取五个ROIs,分别测量得到r ADC及Ktrans值,计算平均值作为该移植瘤的r ADC及Ktrans值。6、比较患者脑胶质瘤与相应小鼠原位移植瘤常规MRI,DWI-及DCE-MRI特征的差异。7、患者脑胶质瘤组织及相应小鼠移植瘤组织石蜡包埋后行苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,H&E staining）和CD34免疫组织化学染色,通过组织病理染色探究患者脑胶质瘤与移植瘤磁共振特征差异的病理基础。8、患者脑胶质瘤组织（Patient tumor 1,2 and 3）及相应小鼠原位移植瘤组织（Xenograft 1,2 and 3）进行转录组测序,比较患者脑胶质瘤与原位移植瘤基因表达的差异。第三部分:抗血管治疗后脑胶质母细胞瘤血管新生方式变化的DCE-MRI评价1、建立U87 BALB/c小鼠原位胶质母细胞瘤模型。2、建模后21天,采用BEV（Bevacizumab,贝伐单抗）和TMZ（Temozolomide,替莫唑胺）单独及联合给药的方式对荷瘤鼠进行药物干预。BEV采用静脉注射的方式,剂量为15mg/kg,给药一次;TMZ采用口服给药的方式,剂量为50mg/kg/天,连续给药5天;TMZ和BEV联合干预时,首先静脉注射BEV,24小时后连续口服TMZ 5天,剂量为50mg/kg/天。对照组用0.9%生理盐水做相同处理。3、荷瘤鼠最后一次给药后1天、3天、6天进行MRI扫描,扫描序列包括T1WI横断位,T2WI冠状位,T1WI增强,DEC-MRI。4、对DCE-MRI原始图像进行后处理后获得Ktransmap,采用热点法,在肿瘤最大层面选择伪彩图上信号较高的5个区域为ROIs,计算平均值得到该移植瘤的Ktrans值。5、荷瘤鼠MRI扫描完成后,完整取出脑组织固定后行H&E染色、免疫组织化学染色（GFAP、CD34、TNC、CD34-PAS）及透射电镜检测。定量分析肿瘤区域微血管密度,血管共生、血管套叠、血管出芽及血管拟态数量。6、使用Spearman相关性分析计算Ktrans与血管新生类型定量参数的相关性并计算相关系数。结果第一部分高级别脑胶质瘤生长早期血管新生相关基因的表达及PWI-MRI监测1、30例原发性高级别胶质瘤手术标本中9例成功建立NOD-SCID小鼠原位胶质瘤模型;能形成小鼠原位胶质瘤模型的病例其肿瘤组织具有更大的微血管密度（P=0.003）及更小的平均微血管管径（P=0.019）。微血管面积与肿瘤组织形成原位胶质瘤模型的能力没有明确关联（P>0.05）。2、具有形成原位移植瘤模型能力的病例其肿瘤组织血管新生相关基因BMPER（Bone morphogenetic protein endothelial cell precursor derived regulator）、CXCL10（Chemokine ligand-10）及HOXA9（Homeobox A9）表达明显高于不能成原位移植瘤模型的肿瘤组织（P=0.043,P=0.002,P=0.002）。3、2例原代肿瘤细胞体外分别抑制BMPER、CXCL10或HOXA9表达后肿瘤细胞成血管能力减弱（P<0.05,P<0.05,P<0.05;P<0.05,P=0.008,P<0.05）。4、小鼠原位移植瘤模型动态监测显示,在肿瘤生长第20天,BMPER呈高表达,CXCL10、HOXA9及肿瘤血管标志CD34呈低表达;在第30天,BMPER呈高表达,CXCL10及HOXA9呈低表达,但CD34表达增高;到第40天BMPER表达降低,CXCL10及HOXA9表达升高,而且与CD34的表达存在空间上的相关性;肿瘤晚期CXCL10、BMPER及HOXA9均呈低表达,CD34呈高表达。5、BMPER、CXCL10及HOXA9高表达的病例DSC-MRI扫描参数r CBV、r CBF以及DCE-MRI扫描参数Ktrans、Vp明显高于低表达的病例（P=0.014,P=0.018,P=0.001,P=0.003）。ROC曲线分析显示,r CBV、r CBF、Ktrans及Vp对上述基因是否高表达具有较好的鉴别能力,r CBV诊断阈值为1.481,曲线下面积为0.861,敏感性及特异性分别为100.00%、75.00%。r CBF诊断阈值为1.289,曲线下面积为0.847,敏感性及特异性分别为100.00%、75.00%。Ktrans诊断阈值为0.209,曲线下面积为0.957,敏感性及特异性分别为100.00%、92.86%。Vp诊断阈值为0.139,曲线下面积为0.871,敏感性及特异性分别为80.00%、85.71%。第二部分:原代脑胶质瘤模型与相应患者脑胶质瘤MRI特征及基因表达差异研究1、移植瘤在小鼠颅内的生长方式分为两类,其中6例移植瘤呈弥散生长（xenografts1,2,3,4,5 and 6）,1例呈结节状生长（xenograft 7）。呈弥散生长的移植瘤与相应患者脑胶质瘤MRI特征的最大差异:移植瘤增强扫描后只有局部区域出现轻度强化,灌注扫描Ktrans map显示肿瘤区域未见明显异常信号;移植瘤周围没有明显水肿信号,肿瘤内部信号均匀。呈结节状生长的移植瘤与相应患者脑胶质瘤MRI特征的最大差异:移植瘤与正常脑组织分界明显,移植瘤强化程度也明显低于相应患者脑胶质瘤7例移植瘤的Ktrans值明显低于相应患者脑胶质瘤,且r ADC值高于相应患者脑胶质瘤（P=0.016,P=0.001）。2、6例呈弥散生长的原位移植瘤组织与患者脑胶质瘤组织CD34染色:移植瘤微血管面积及微血管管径明显低于相应患者脑胶质瘤（P=0.009,P=0.007）,而微血管密度在移植瘤与患者脑胶质瘤之间没有明显差别;结节状生长的移植瘤组织与患者脑胶质瘤H&E染色:移植瘤与正常脑组织边界较清楚而患者脑胶质瘤边界不清。3、原代原位移植瘤与相应患者脑胶质瘤之间存在明显的基因表达差异:Patient-1与Xenograft-1相比差异表达的基因共有3590个,Patient-2与Xenograft-2相比差异表达的基因共有5408个,Patient-3与Xenograft-3相比差异表达的基因共有3590个;对差异表达的基因进行聚类分析（GO analysis）显示,与原位移植瘤相比,患者脑胶质瘤血管生成相关基因（Angiogenesis and vasculature development related genes）,肿瘤细胞特性及细胞外基质相关基因（cell activation,cell adhesion,cell migration,cell motility and extracellular matrix related genes）,以及免疫相关基因（immune response,immune system process and immune effector process related genes）表达较高。而细胞周期及核分裂相关基因表达下降。第三部分:抗血管治疗后脑胶质母细胞瘤血管新生方式变化的DCE-MRI评价1、U87原位移植瘤内共鉴定出四种类型的血管新生,即血管共生、血管出芽、血管套叠及血管拟态。2、BEV干预组:给药后3天实验组血管出芽及血管套叠数量显着减少（P<0.05,P=0.002）。到给药后6天实验组微血管密度、血管套叠、血管共生及血管出芽数量数量明显减少（P<0.05,P=0.001,P<0.05,P<0.05）,但是与对照组相比实验组血管拟态数量反而增高（P<0.05）。3、TMZ干预组:最后一次给药后3天实验组微血管密度、血管共生、血管出芽及血管套叠数量明显减少（P<0.05,P=0.001,P=0.001,P<0.05）。给药后6天实验组与对照组相比微血管密度反而增高（P=0.003）,但血管共生数量、血管出芽数量、血管套叠数量及血管拟态数量在实验组与对照组之间均无明显差异。血管套叠是对TMZ最敏感的新血管生成方式,在TMZ干预1天后即明显减少（P=0.001）。4、BEV和TMZ联合干预组:实验组肿瘤区域微血管密度、血管共生、血管出芽及血管套叠数量在最后一次给药后1天（P<0.05,P<0.05,P<0.05,P=0.01）及3天（P=0.003,P<0.05,P<0.05,P=0.025）都显着减少,血管拟态数量在两组之间没有明显差别。最后一次给药后6天,药物对肿瘤微血管的影响开始减弱,实验组与对照组相比只有血管出芽数量减少（P<0.05）,而微血管密度、血管套叠、血管共生及血管拟态数量均无明显差异。5、药物干预后U87原位移植瘤DCE-MRI特征变化:BEV单独干预组,从给药后1天到6天移植瘤Ktrans值均明显低于对照组（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。TMZ单独干预组,最后一次给药后1天实验组与对照组之间移植瘤Ktrans值没有明显差异,给药后3天移植瘤Ktrans值显着降低（P<0.05）,但是给药后6天Ktrans值反而高于对照组（P=0.007）。BEV和TMZ联合干预组,移植瘤Ktrans值的变化与BEV单独干预组类似,最后一次给药后1天、3天及6天实验组移植瘤Ktrans值均低于对照组(（P=0.022,P<0.05,P<0.05）。6、Spearman相关性分析显示,药物干预后血管出芽数量与移植瘤Ktrans值有较好的相关性,BEV和TMZ单独或联合干预后,随时间的变化血管出芽数量与Ktrans值呈显着正相关,r的值分别为0.9068、0.9806、0.8641（P<0.05）。结论:1、原发性高级别胶质瘤中,BMPER、CXCL10以及HOXA9通过促进肿瘤血管新生而促进肿瘤早期生长与进展,有可能成为抗血管治疗的新靶点;DSC-MRI及DCE-MRI扫描参数r CBV、r CBF、Vp及Ktrans可以作为影像标志物无创预测肿瘤组织BMPER、CXCL10及HOXA9的表达程度。2、原代小鼠原位移植瘤模型并不能复制相应患者脑胶质瘤的MRI特征,而基因的差异表达可能是造成移植瘤与相应患者脑胶质瘤MRI特征差异的重要原因,因此移植瘤来源的MRI标志在临床应用时需要谨慎使用。3、BEV干预后胶质母细胞瘤肿瘤区域血管拟态数量的增多,以及TMZ治疗后微血管密度反弹性的增高,可能是胶质母细胞瘤抗血管治疗失败的重要原因;BEV和TMZ单独或联合干预后,血管出芽数量的变化与Ktrans值呈正相关,Ktrans值可以作为监测药物干预后血管出芽变化的潜在有效影像学指标。
韦芊含[8]（2020）在《shRNA干扰Vegfr2研究洛克沙胂体内促血管作用及对VEGFR2-mTOR的影响》文中提出洛克沙胂（Roxarsone,Rox）具有促生长、抗菌、抗球虫等功效,作为饲料添加剂在畜禽生产中被广泛使用。但近年来研究表明Rox在体内外可促进血管生成,存在着诱导血管新生相关疾病发生的风险。VEGF可与血管内皮细胞表面的VEGFR2结合进而将信号传导至下游,对血管新生发挥调控作用。mTOR是PI3K/AKT信号通路的下游分子,在肿瘤生成和血管生成中具有调控作用。本课题组前期研究中发现Rox在体内外能够促进血管生成,使VEGF/VEGFR2以及PI3K/AKT表达上调。本文借助课题组前期构建的靶向Vegfr2基因shRNA重组慢病毒,转染大鼠血管内皮细胞并用于小鼠基质胶塞模型,以及利用小鼠黑色素移植瘤模型的体内试验,通过Rox或雷帕霉素处理,考察对基质胶塞、移植瘤及其血管生长的影响;Western Blot检测VEGF/VEGFR2、mTOR相关蛋白的表达,研究Rox体内促血管生成中VEGF/VEGFR2-mTOR 调节机制。在小鼠基质胶塞模型的体内试验中,血管内皮细胞与基质胶注射于小鼠皮下,建立基质胶塞模型。不同处理如下:PBS组、1.0 μM Rox处理组、shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）。测定胶塞的重量、体积及血红蛋白含量,并对胶塞进行HE染色及CD34免疫组化分析,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明,Rox组基质胶塞体积、重量及血红蛋白含量均显着增加,分别是PBS组的2.10、1.69、1.49倍;胶塞组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达水平亦显着升高（P<0.05）。与Rox组相比,Rox+RNAi组胶塞的体积、重量、血红蛋白、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达均显着调降低（P<0.05）。靶向Vegfr2基因shRNA干扰可显着抑制Rox对基质胶塞的生长及其血管生成的促进作用,对Rox引起的mTOR信号上调也有显着抑制作用。在小鼠B16F10黑色素移植瘤模型中,不同处理分组如下:PBS组、25 mg/kg Rox组、shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）、阴性shRNA感染对照组（NC组）。重组慢病毒与B16F10细胞注射于小鼠腋下,于注射第二天连续7天灌胃给予Rox或PBS,每天1次。测量小鼠体重、肿瘤体积及重量;肿瘤组织进行HE染色及CD34免疫组化分析,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明Rox处理组小鼠的移植瘤体积和重量均显着增加,瘤重约为PBS组的1.53倍;Rox+RNAi组瘤重极显着减小,约是Rox组的0.65倍。Rox组肿瘤组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达均显着上调（P<0.05）。与Rox组比较,Rox+RNAi组肿瘤组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白表达均显着降低（P<0.05）。靶向Vegfr2基因shRNA干扰可显着抑制Rox对B16F10移植瘤及其血管生长的促进作用,对Rox引起的mTOR信号上调也有显着抑制。在大鼠血管内皮细胞的体外试验中,不同处理分为PBS组、1.0μM Rox处理组、靶向Vegfr2基因shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）、Rox与雷帕霉素共处理组（Rox+RAPA组）、雷帕霉素处理组（RAPA组）和shRNA阴性对照组（NC组）。MTT法检测血管内皮细胞的活性,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明Rox能够促进血管内皮细胞生长,显着上调VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达（P<0.01）。与Rox组比较,Rox+RNAi组细胞活力、VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白水平均显着降低（P<0.05）;Rox+RAPA组VEGFR2及mTOR表达无显着差异,但VEGF和p-mTOR的表达极显着降低（P<0.001）。靶向Vegfr2基因的RNA干扰可显着抑制Rox对内皮细胞生长,及VEGF/VEGFR2-mTOR信号的促进作用;RAPA可抑制Rox对内皮细胞的促进作用,并下调VEGF、p-mTOR蛋白的表达。综上所述,洛克沙胂在体内可显着促进基质胶塞和小鼠黑色素移植瘤的生长及其血管生成,靶向Vegfr2基因RNAi可有效抑制洛克沙胂对基质胶塞和黑色素移植瘤的生长及血管生成。VEGF/VEGFR2-mTOR信号在Rox体内促血管生成中发挥重要调节作用。
成艳桃[9]（2020）在《斑马鱼cd34家族成员cDNA克隆、发育时序分析及CD34多克隆抗血清制备》文中认为本论文旨在发掘斑马鱼体内类似于哺乳动物cd34家族基因的同源基因,克隆并检测其发育时序、制作相应的抗血清。在NCBI数据库和Ensembl数据库中存在预测为斑马鱼podxl的基因,该基因属于cd34基因家族成员,但尚未在该数据库中发现标注为斑马鱼cd34和podxl2这两个cd34基因家族其他成员的基因存在。我们通过对哺乳动物cd34和podxl2基因的共线性分析和初步的同源性分析,在Ensembl数据库中获得了斑马鱼cd34两个直系同源基因序列（si:ch211-286o17.1和si:dkey-261h17.1）和podxl2同源基因（ZGC:171566）,我们将cd34同源基因分别命名为cd34l1和cd34l2。关于cd34l1和cd34l2在斑马鱼体内发育时序表达以及发挥的功能尚未知晓,为了逐步解决这些问题,本文以模式生物斑马鱼为研究对象,采用RACE的方法克隆cd34l1、cd34l2、podxl和podxl2的cDNA序列并对其进行生物信息学分析。采用半定量RT-PCR检测了斑马鱼cd34家族的发育时序表达情况,对于cd34l1和cd34l2在斑马鱼早期发育时序表达情况利用斑马鱼全胚原位杂交进行了补充。通过构建CD34L1、CD34L2和CD34L2-2原核表达重组质粒,从而进行CD34L1、CD34L2和CD34L2-2蛋白的表达与纯化,并利用纯化的蛋白免疫实验兔从而制备斑马鱼CD34L1、CD34L2和CD34L2-2兔源多克隆抗血清,并利用间接ELISA法和Western blot法分别对该抗血清进行效价和抗原识别能力进行了验证。实验结果如下:1.斑马鱼cd34家族cDNA克隆和生物信息学分析斑马鱼cd34l1基因cDNA长度为1631 bp,ORF长度为867 bp,编码288个氨基酸。斑马鱼cd34l2基因cDNA长度为1975 bp（另一剪切体cd34l2-2长度1918bp）,ORF长度为828 bp（771 bp）,编码275（256）个氨基酸。斑马鱼podxl基因cDNA长度为2843 bp,ORF长度为1338 bp,编码445个氨基酸。斑马鱼podxl2基因cDNA长度为2457 bp,ORF长度为1764 bp,编码587个氨基酸。蛋白结构分析表明斑马鱼CD34L1、CD34L2、CD34L2-2、PODXL和PODXL2蛋白为跨膜蛋白,其结构包含信号肽、跨膜结构域和Pfam:CD34antigen结构域。系统进化分析表明,斑马鱼CD34L1、CD34L2、CD34L2-2、PODXL和PODXL2与鱼类聚为一支,之后与哺乳类聚为一支。2.斑马鱼cd34家族基因的发育时序表达分析半定量RT-PCR研究斑马鱼cd34l1、cd34l2、cd34l2-2、podxl和podxl2在不同发育时间的表达,结果显示,斑马鱼cd34l1和podxl在6 hpf时尚未开始表达,而斑马鱼cd34l2和podxl2在6 hpf时已经开始表达,但是斑马鱼cd34l2-2在所选引物进行PCR时,未见有所表达。构建pGEMT-cd34l1-A和pGEMT-cd34l2-A,用于反义探针合成,通过全胚原位杂交来检测斑马鱼cd34l1和cd34l2基因的表达。结果显示,发育到12 hpf时,cd34l1和cd34l2集中表达于胚环位置,之后逐步表达于胸腺、肾脏及眼部附近。3.斑马鱼CD34L1、CD34L2和CD34L2-2多克隆抗血清制备及验证通过构建斑马鱼CD34L1、CD34L2和CD34L2-2胞外特异性片段的重组原核表达质粒,并将其转化入大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。使用Ni-琼脂糖凝胶6FF亲和纯化蛋白,将纯化的目的蛋白与免疫佐剂作为抗原皮下背部多点注射实验兔（雌雄各一只）,最终获得CD34L1、CD34L2和CD34L2-2多克隆抗血清。间接ELISA法检测制备的雌兔和雄兔zCD34L1和zCD34L2多克隆抗血清效价大于1:5120000、雌兔zCD34L2-2多克隆抗血清效价大于1:5120000、雄兔zCD34L2-2多克隆抗血清效价大于1:320000。Western blot验证制备的多克隆抗血清不仅能够识别原核表达的融合蛋白,而且能够识别293T细胞表达的重组蛋白。由此得出以下结论:1.通过RACE技术获得的cDNA序列为斑马鱼cd34l1、cd34l2（cd34l2-2）、podxl和podxl2基因cDNA序列,生物信息学分析表明,斑马鱼cd34l1、cd34l2（cd34l2-2）、podxl和podxl2是哺乳动物直系同源基因,斑马鱼cd34l1和cd34l2的存在有可能是因为部分硬骨鱼特有的染色体加倍事件造成的,cd34l2和cd34l2-2两个转录本的存在是源于mRNA选择性剪切,为深入研究斑马鱼CD34家族分子奠定了研究基础。2.斑马鱼早期发育过程中表达cd34l1、cd34l2、podxl和podxl2,cd34l1和cd34l2不仅在造血组织如ICM区、CHT和肾脏,非造血组织如眼睛、脑和胸腺等组织也有表达,为深入研究斑马鱼CD34家族分子奠定了基础。3.成功制备兔源zCD34L1、zCD34L2和zCD34L2-2多克隆抗血清,为深入研究斑马鱼CD34分子提供了一个很好的基础工具。
张丽芙[10]（2020）在《MiR-526b-3p在阿霉素引起的血管内皮细胞损伤中的作用机制研究》文中认为阿霉素（Doxorubicin,DOX）是一种广谱的肿瘤化疗药物,广泛用于乳腺癌、血液系统肿瘤和消化道肿瘤等多种恶性肿瘤的化疗,然而,由于阿霉素并非特异性地作用于肿瘤细胞,故在抑制肿瘤的同时也可以对正常的组织细胞产生一定程度的抑制作用,即阿霉素的毒副作用。在阿霉素毒副作用中,心脏毒性最为明显,因而也是研究的热点。目前的研究多集中于阿霉素对心肌细胞的毒性作用,然而,阿霉素对非心肌细胞如血管内皮细胞功能影响的研究比较少。心肌微小血管稳态尤其是心肌微小血管的内皮细胞对心肌细胞功能具有重要作用,阿霉素对血管内皮细胞及血管稳态的影响可能参与了阿霉素相关的心肌细胞毒性作用。有研究显示血管内皮生长因子VEGFA在维持血管结构和功能中起着非常重要的作用,而阿霉素能够抑制VEGFA的表达,本研究组在预实验中应用基因芯片筛查出高表达的miR-526b-3p,同时发现高表达的miR-526b-3p对小鼠心脏功能以及微血管具有损伤作用。本研究旨在探讨miR-526b-3p在阿霉素诱导的血管内皮细胞损伤中的作用及机制,为预防和治疗阿霉素相关的心脏毒性提供新靶点和新方法。第一部分 miR-526b-3p在阿霉素引起的微血管和心脏功能损伤中的作用目的:研究阿霉素对miR-526b-3p表达的影响及对小鼠微血管和心脏功能的损伤作用;进一步研究高表达miR-526b-3p对阿霉素诱导的小鼠心脏功能、微小血管损伤作用的影响。方法:1.将10只C57BL/6雌性小鼠按阿霉素干预与否分为对照组和阿霉素组（DOX组）,阿霉素组给予阿霉素（DOX）25mg/kg一次性腹腔注射,对照组则给予等量的生理盐水。2周后进行心脏超声测定左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（FS）;采用免疫组化检测心肌组织CD31/CD34水平;基因芯片技术检测miRNA的表达水平。2.将40只C57BL/6雌性小鼠按照处理方法分为对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs组和DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut组。rAAV为重组的腺相关病毒载体。各组详细情况见正文。经尾静脉注射腺相关病毒载体1μL、1×1011滴腺相关病毒转染小鼠,2周后,应用qrt-PCR法检测miR-526b-3p的表达情况,确认转染效果。转染成功后,除对照组外的所有组给予一次性腹腔注射阿霉素（DOX）25mg/kg。2周后对对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP组和DOX+rAAV-miR-526b-3p组小鼠进行心脏超声检测左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（FS）以评估miR-526b-3p对心脏功能的影响;采用免疫组化法检测各组小鼠心肌组织CD31/CD34的水平以评估血管密度情况。结果:1、基因芯片检测结果显示,阿霉素组小鼠心肌组织中miR-526b-3p的表达水平显着升高（分别为4.94±0.49和1.00±0.12,p<0.01）。免疫组化染色实验检测结果显示,血管密度标志蛋白CD31和CD34的水平降低,DOX组的心肌组织CD31的免疫组织化学染色阳性低于对照组（分别为0.65±0.09和1.00±0.16,p<0.01）;DOX组心肌组织CD34的免疫组织化学染色阳性亦显着低于对照组（分别为0.63±0.09和1.00±0.10,p<0.01）。2、在阿霉素小鼠采用腺病毒转染形成过表达miR-526b-3p、抑制表达miR-526b-3p以及表达突变的miR-526b-3p,确认转染效果,结果显示对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs组和 DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut 组的 miR-526b-3p 相对表达水平分别为 1.00±0.11、4.26±0.53、4.54±0.11、9.72±1.39、1.26±0.19 和 4.08±0.68。与 DOX+rAAV-GFP组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p 组的 miR-526b-3p 表达量明显增高（p<0.01）;与DOX+rAAV-miR-526b-3p 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs组的 miR-526b-3p表达量明显下降（p<0.01）;DOX组与DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut组之间无显着差别（p>0.05）,说明小鼠实验模型建立成功。3、检测miR-526b-3p对心脏微血管标记物CD31/CD34的影响,对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs组和 DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut 组 CD31 相对水平分别为 1.00±0.15、0.69±0.10、0.73±0.11、0.45±0.07、0.85±0.10 和 0.59±0.06。与DOX+rAAV-GFP 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3P 组 CD31 水平显着降低（p<0.01）;与 DOX+rAAV-miR-526b-3P组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs 组 CD31 水平升高（p<0.01）;DOX 组与DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut组之间无显着性差异（p>0.05）;以上六组CD34相对水平分别为 1.00±0.14、0.70±0.08、0.56±0.07、0.41±0.43、0.82±0.12 和 0.59±0.07。与DOX+rAAV-GFP 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3P 组 CD34 水平显着降低（p<0.01）;与 DOX+rAAV-miR-526b-3P 组比,DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs 组 CD34 水平显着升高（p<0.01）;DOX 组与 DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut 组之间无显着性差异（p>0.05）,表明DOX使miR-526b-3p表达水平升高,而miR-526b-3p表达升高减少了小鼠心肌组织中微血管密度和数量。4、检测miR-526b-3p对小鼠心脏FS、LVEF的影响,对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP 组和 DOX+rAAV-miR-526b-3p 组的 LVEF 分别为（78.03±14.84）%、（5 7.12±14.58）%、（56.06±18.86）%和（20.18±4.25）%。与对照组相比,DOX 组的 LVEF 显着下降（p<0.01）;与 DOX+rAAV-GFP 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p组的 LVEF 显着下降（p<0.01）;以上四组的 FS 分别为（54.27±5.48）%、（28.75±3.83）%、（26.65±4.25）%和（11.80±2.67）%。与对照组相比,DOX 组的 FS 显着下降（p<0.01）;与 DOX+rAAV-GFP 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p 组的 FS 显着下降（p<0.01）,结果表明高表达miR-526b-3p损害心脏功能。结论:阿霉素使小鼠心脏miR-526b-3p的表达水平增高、血管内皮标志物CD31和CD34的阳性率降低、小鼠的心脏功能指标LVEF和FS降低;高表达miR-526b-3p加重了阿霉素对心肌微小血管和心脏功能的损害作用,抑制miR-526b-3p表达则能减弱上述损害作用,表明miR-526b-3p参与了阿霉素引起的心肌血管和心脏功能的损伤作用。第二部分 MiR-526b-3p在阿霉素引起的HUVEC损伤中的作用目的:探讨MiR-526b-3p在阿霉素引起的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）损伤中的作用。方法:采用 MiR-526b-3p 类似物（MiR-526b-3p mimic）及 MiR-526b-3p 抑制剂（miR-526b-3p inhibitor）以及相应的阴性对照物（NC mimics、NC inhibitor）分别转染HUVEC 36小时后加阿霉素处理。根据处理因素分为对照组、DOX组、DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+NC inhibitor 组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor组。其中对照组和阿霉素组不转染核酸。各组详细情况见正文。各组中miRNA相关制剂5 μL,阿霉素5μM。阿霉素处理12小时后,应用RT-PCR方法测定各组miR-526b-3p的相对表达量,确认转染效果;后采用EDU方法检测血管内皮细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡,Matrigel基质胶评估成管能力,transwell小室方法评估细胞迁移能力。结果:1、确认转染效果:对照组、DOX 组、DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+NC inhibitor 组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的 miR-526b-3p 相对表达量分别为 1.00±0.11、5.61±0.85、5.13±0.78、10.53±1.20、4.77±0.53 和 1.82±0.26。与对照组比较,DOX组的miR-526b-3p表达水平显着上调（p<0.01）;与DOX+NC mimics组比较,DOX+miR-526b-3p mimics组的miR-526b-3p表达水平显着上调（p<0.01）;与 DOX+NC inhibitor 组比较,DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的miR-526b-3p表达水平显着下降（p<0.01）。2、增殖方面:各组值分别为 62.00±6.24、25.67±4.73、29.33±3.51、12.33±3.51、26.87±5.06和54.33±3.51。对比对照组,DOX组的EdU活性显着下降（p<0.01）;对比 DOX+NC mimics 组,DOX+miR-526b-3p mimics 组的 EdU 活性显着下降（p<0.01）;对比 DOX+NC inhibitor 组,DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的 EdU 活性显着上升（p<0.01）。3、细胞凋亡:对照组、DOX 组、DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics组、DOX+NC inhibitor 组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的相对值分别为 1.03±0.06、2.95±0.19、3.14±0.26、4.95±0.30、2.95±0.25 和 1.50±0.42。与 control 组比,DOX组的细胞凋亡水平显着升高（p<0.01）;与NC mimc组相比,miR-526b-3p mimc组的细胞凋亡水平显着升高（p<0.01）;与NC inhibitor组相比,miR-526b-3p inhibitor组的细胞凋亡水平显着下降（p<0.01）。4、成管能力:对照组、DOX 组、DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics组、DOX+NC inhibitor 组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的相对值分别为 0.99±0.01、0.25±0.11、0.28±0.11、0.10±0.02、0.31±0.06 和 0.92±0.02。对比对照组,DOX 组的小管形成能力显着下降（p<0.01）;对比 DOX+NC mimics 组,DOX+miR-526b-3p mimics组的小管形成能力显着下降（p<0.01）;对比DOX+NC inhibitor组,DOX+miR-526b-3p inhibitor组的小管形成能力显着上升（p<0.01）。5、细胞迁移能力:对照组、DOX组、DOX+NC mimics组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+NC inhibito组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的迁移能力相对值分别为 0.99±0.01、0.32±0.04、0.35±0.03、0.09±0.03、0.29±0.04和0.89±0.04。对比对照组,DOX组的细胞迁移能力显着下降（p<0.01）;对比DOX+NC mimics组,DOX+miR-526b-3p mimics组的细胞迁移能力显着下降（p<0.01）;对比 DOX+NC inhibitor 组,DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的细胞迁移能力显着上升（p<0.01）。结论:阿霉素使miR-526b-3p表达上调,而高表达miR-526b-3p加剧了阿霉素对脐静脉内皮细胞的损害包括抑制脐静脉内皮细胞的增殖活性、促凋亡、抑制成管能力和抑制迁移能力等,因此,阿霉素引起的脐静脉内皮细胞损伤极有可能是通过上调miR-526b-3p的表达实现的,即miR-526b-3p参与了阿霉素引起的血管内皮细胞的损伤。第三部分 VEGFA在miR-526b-3p引起的HUVEC损伤中的作用目的:探讨VEGFA是否能够减弱miR-526b-3p对HUVEC的损伤作用。方法:1.探索阿霉素对VEGFA表达的影响时分为对照组（control）和DOX组。对照组不给与任何干预,DOX组给与终浓度为5 μM的阿霉素处理。2.构建高表达VEGFA 的 pcDNA3.1-VEGFA 质粒、空白的pcDNA 质粒,应用 miR-526b-3p mimics/NC mimics进行分组转染HUVEC,探索VEGFA对细胞的影响时分为DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA组和DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA组。各组详细情况见正文。相关pcDNA剂量为2μg,相关miRNA剂量为5μL,阿霉素终浓度为5μM。转染36小时后加阿霉素处理12小时,对转染了 pcDNA质粒的各组细胞采用RT-PCR检测各组VEGFA mRNA的相对表达量以确认转染效果,采用EDU方法检测血管内皮细胞的增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡、Matrigel基质胶评估成管能力和transwell小室方法评估细胞迁移能力。结果:1、DOX对VEGFA的表达影响:对照组和DOX组的VEGFA mRNA表达水平分别为1.00±0.13和0.38±0.04,组间差异有统计学意义（p<0.01）,表明DOX抑制VEGFAmRNA 的表达。2、VEGFA 对细胞活性的影响:DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA 组 和 DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的细胞活性值分别为 30.30±2.36、14.17±3.01、30.83±3.55、66.00±4.58 和 23.17±3.01。DOX+miR-526b-3p mimics 组的 EdU 活性显着低于 DOX+NC mimics 组（p<0.01）;DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的 EdU 活性显着高于 DOX+miR-526b-3p mimics 组（p<0.01）;DOX+pcDNA-VEGFA 组的 EdU 活性显着高于DOX+pcDNA组（p<0.01）,说明VEGFA促进细胞的活性。3、VEGFA 对细胞凋亡的影响:DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA 组 和 DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的细胞凋亡相对值分别为 0.98±0.02、2.19±0.18、1.01±0.02、0.38±0.06 和 1.12±0.13。DOX+miR-526b-3p mimics 组的细胞凋亡水平显着高于DOX+NC mimics 组（p<0.01）;DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的细胞凋亡水平显着低于 DOX+miR-526b-3p mimics 组（p<0.01）;DOX+pcDNA-VEGFA 组的细胞凋亡水平显着低于DOX+pcDNA组（p<0.01）,说明VEGFA减弱细胞的凋亡。4、VEGFA 对细胞成管能力的影响:DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA 组和 DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA组的小管形成能力相对值分别为0.99±0.01、0.30±0.04、1.01±0.02、2.62±0.13 和 1.18±0.20。DOX+miR-526b-3p mimics 组的小管形成能力显着低于 DOX+NC mimics 组（p<0.01）;DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的小管形成能力显着低于 DOX+miR-526b-3p mimics 组（p<0.01）;DOX+pcDNA-VEGFA组的小管形成能力显着高于DOX+pcDNA组（p<0.01）。说明VEGFA促进细胞的成管能力。5、VEGFA 对细胞迁移能力的影响:DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA 组和 DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA组的细胞迁移能力相对值分别为0.99±0.01、0.35±0.02、0.10±0.01、2.05±0.08 和 0.84±0.05。DOX+miR-526b-3p mimics 组的细胞迁移能力显着低于 DOX+NC mimics 组（p<0.01）;DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的细胞迁移能力显着高于DOX+miR-526b-3p mimics组（p<0.01）;DOX+pcDNA-VEGFA组的细胞迁移能力显着高于DOX+pcDNA组（p<0.01）。说明VEGFA促进细胞的迁移能力。结论:阿霉素可降低VEGFA mRNA的表达,低表达的VEGFA加重miR-526b-3p介导的阿霉素对血管内皮细胞的损害作用;引入VEGFA则能减弱miR-526b-3p介导的阿霉素对血管内皮细胞的损害作用,引入VEGFA有望成为改善阿霉素心脏毒性患者的心脏功能的一种新的治疗方法。第四部分 MiR-526b-3p对VEGFA调控作用的机制研究目的:探讨MiR-526b-3p对VEGFA的调控机制。方法:1、探索miR-526b-3p对VEGFA的调控时转染分组分为DOX+NC mimics组（简称 NC mimics 组）、DOX+miR-526b-3p mimics 组（简称 miR-526b-3p mimics 组）、DOX+NC inhibitor 组（简称 NC inhibitor 组）和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 转染组（简称miR-526b-3p inhibitor组）。各组详细情况见正文。miRNA制剂5μL,转染36 h后加入终浓度为5 uM的阿霉素,处理12小时。应用RT-PCR法检测各组VEGFA mRNA的表达情况。2、构建含VEGFA3’UTR区序列的pcDNA-EGFP-VEGFA载体,按照实验分为NC mimics+pcDNA3.1-EGFP-VEGFA 组,miR-526b-3p mimics+pcDNA3.1-EGFP-VEGFA 组,NC inhibitor+pcDNA3.1-EGFP-VEGFA 组和 miR-526b-3p inhibitor+pcDNA3.1-EGFP-VEGFA组。各组详细情况见正文。转染时,相关载体0.5μg,相关miR制剂0.25uL,转染24小时后加终浓度为5 μM的阿霉素处理12小时,随后检测GFP强度,组间进行相对荧光强度比较以探索miR-526b-3p与VEGFA3’UTR是否结合。3、构建含VEGFA启动子区序列的PGL3载体,按实验需要分为pGL3-VEGFA+PRL-SV40+NC mimics 组、pGL3-VEGFA+PRL-SV40+miR-526b-3p mimics组、pGL3-VEGFA+PRL-SV40+NC inhibitor 组 和pGL3-VEGFA+PRL-SV40+miR-526b-3p inhibitor 组。pGL3 质粒是一个将含 VEGFA启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒。PRL-SV40为海肾荧光素酶报告基因载体,作为荧光素酶报告基因的内参对照。各组详细情况见正文。转染时,相关载体0.5 μg,相关miR制剂0.25 μ L,转染24小时后加5 μ M的阿霉素处理24小时,随后检测荧光素酶活性强度以探索miR-526-3p与VEGFA启动子是否有结合。4、JASPAR网页查询STAT3在VEGFA启动子上的结合位点;生物信息学软件Starbase2.0查找STAT3与miR-526b-3p之间结合的潜在靶点序列。5、研究STAT3对VEGFA的调控作用时转染分组为si-NC组、si-STAT3#1组、si-STAT3#2 组、pcDNA3.1 组和 pcDNA3.1/STAT3 组。其中,si-NC 组为阴性对照,si-STAT3#1组和si-STAT3#2组为STAT3不同序列位点的小核苷酸干扰物,pcDNA3.1组为不表达STAT3的空载的载体,pcDNA3.1/STAT3组为高表达STAT3的载体。其中,小干扰RNA转染终浓度为100nM,体积为10 uL;质粒DNA转染量为4μg每孔,以上各组转染36小时后加5 μ M的阿霉素处理12小时,应用RT-PCR法检测各组VEGFA mRNA的表达情况。6、CHIP实验研究STAT3与VEGFA的结合位点。7、荧光素酶报告基因实验检验STAT3与VEGFA上的启动子1（BS1）的结合:构建携带有STAT3在VEGFA启动子上可能的结合位点BS1的野生型和突变型质粒（即PGL3-BS1WT/MUT）、高表达STAT3或空载的pcDNA3.1质粒（即质粒pcDNA3.1/STAT3 或 pcDNA3.1）以及抑制表达 STAT3 的 siRNA（即 si-STAT3#1 和si-STAT3#2,分别为序列不同位点的干扰序列）。实验分组为PGL3-BS 1 WT/MUT+si-NC 组、PGL3-BS1WT/MUT+si-STAT3#1 组、PGL3-BS1WT/MUT+si-STAT3#2 组、PGL3-BS1 WT/MUT+pcDNA3.1 和PGL3-BS1WT/MUT+pcDNA3.1/STAT3组。各组详细情况见正文。转染24小时后加5μ M的阿霉素处理24小时后进行荧光素酶检测。相关DNA质粒0.5 μg,相关siRNA100nM,10 μ L。8、检测miR-526b-3p与STAT3的结合:将构建好的含 STAT3 3’UTR野生型和突变型质粒psiCHECK2-STAT3 WT/MUT与细胞转染时分为psiCHECK2-STAT3 WT/MUT+NC mimics 组、psiCHECK2-STAT3 WT/MUT+miR-526b-3p mimics 组、psiCHECK2-STAT3 WT/MUT+NC inhibitor 组 和 psiCHECK2-STAT3 WT/MUT+miR-526b-3p inhibior组。各分组详细情况见正文。相关质粒0.5μg,相关miRNA制剂0.25 μ L,转染36小时后加终浓度为5 μ M的阿霉素,继续处理12小时再进行荧光素酶检测。结果:1、miR-526b-3p负性调控VEGFA及作用方式:①miR-526b-3p负性调控VEGFA:与NC mimics组相比,VEGFA mRNA水平在miR-526b-3p mimics组显着下降,分别为 1.00±0.15 和 0.33±0.03（p<0.01）;与 NC inhibitor 组相比,VEGFA mRNA 水平在miR-526b-3p inhibitor 组显着上升,分别为 1.00±0.13 vs 3.41±0.58（p<0.01）。②miR-526b-3p 与 VEGFA 3’UTR 无结合作用:对比 DOX+NC mimics 组,DOX+miR-526b-3p mimics组的EGFP荧光素酶活性并没有明显变化,分别为1.00±0.11 和 1.07±0.15（p>0.05）;对比 DOX+NC inhibitor 组,DOX+miR-526b-3p inhibitor组的EGFP荧光素酶活性并没有明显变化,分别为1.00±0.15和0.96±0.13（p>0.05）。③miR-526b-3p 抑制 VEGFA 的启动子活性:与 NC mimics 组相比,miR-526b-3p mimics组的VEGFA启动子活性显着受到抑制,分别为1.00±0.13和0.30±0.04（p<0.01）;与NC inhibitor组相比,miR-526b-3p inhibitor组的VEGFA的启动子活性显着升高,分别为 1.00±0.10 和 2.47±0.38（p<0.01）。2、JASPAR分析显示VEGFA启动子和STAT3具有两个有效的结合位点（BS1,BS2）,生物信息学软件Starbase2.0查找到STAT3与miR-526b-3p之间结合的潜在靶点序列。3、STAT3正向调节VEGFAmRNA的表达:与si-NC组相比,si-STAT3#1组和si-STAT3#2组的VEGFA mRNA表达水平显着降低,分别为1.00±0.17、0.35±0.05和0.30±0.04（p<0.01）;与 pcDNA3.1 组相比,pcDNA3.1/STAT3 组的 VEGFA mRNA 表达水平显着升高,分别为1.00±0.18和3.32±0.42（p<0.01）。4、染色质免疫共沉淀实验检验STAT3在BS1与VEGFA结合:在 BS1 结合位点中 IgG 与 STAT3 分别为 0.93±0.10 和 28.29±4.7（p<0.01）;在BS2 结合位点中 IgG 与 STAT3 分别为 0.96±0.11 和 1.23±0.20（p>0.05）。5、荧光素酶实验检验STAT3在预测位点1（BS1）与VEGFA启动子结合:在BS1野生型组中,与si-NC组相比,si-STAT3#1组和si-STAT3#2组的荧光素酶活性被显着抑制,分别为 1.00±0.15 和 0.29±0.04/0.33±0.05（p<0.01）;与 pcDNA3.1 组相比,pcDNA3.1/STAT3组的荧光素酶活性显着升高,分别为1.00±0.13和2.52±0.38（p<0.01）。在BS1突变组中,与si-NC组相比,si-STAT3#1组和si-STAT3#2组的荧光素酶活性无明显变化,分别为1.00±0.16、1.04±0.15和0.88±0.13（p>0.05）;与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1/STAT3组的荧光素酶活性无明显变化,分别为1.00±0.11和 1.00±0.13（p>0.05）。6、miR-526b-3p负向调控STAT3:构建STAT3野生型和STAT3突变型荧光素酶报告基因,在STAT3-WT中,对比NC mimics组,miR-526b-3p mimics组的荧光素酶活性显着下降,分别为1.00±0.13和0.16±0.05（p<0.01）;对比NC inhibitor组,miR-526b-3p inhibitor组的荧光素酶活性显着升高,分别为1.00±0.15和2.39±0.38（p<0.01）。在STAT3-MUT 组中,NC mimics 组、miR-526b-3p mimics 组、NC inhibitor组和miR-526b-3p inhibitor组的荧光素酶活性不变,分别为1.00±0.14、1.01±0.11、0.92±0.14和0.96±0.11,差异无统计学意义（p>0.05）,说明miR-526b-3p负向调控STAT3。结论:miR-526b-3p通过与VEGFA启动子而非其3’ UTR结合实现其负向调控作用,JASPAR分析结果表明VEGFA启动子和STAT3具有两个有效的结合位置（BS1,BS2）,且STAT3通过与VEGFA启动子的BS1位点结合实现对VEGFA的正向调控作用;而miR-526b-3p又通过STAT33’ UTR负向调控STAT3,综合分析得出,miR-526b-3p负向调控STAT3从而抑制VEGFA的转录,至此,我们发现miR-526b-3p/STAT3/VEGFA这一环路参与了阿霉素相关的心肌微血管、心脏功能损伤。
二、CD34基因与血管内皮细胞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CD34基因与血管内皮细胞（论文提纲范文）
（1）MAPK4通过调节内皮细胞增殖促进非小细胞肺癌体内生长的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ERK3/ERK4:结构、活化、功能及在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）从血管新生方向探讨miR-221-3p对心肌梗死保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 实验第一部分:miR-221-3p在心肌梗死大鼠心肌组织中的细胞定位及表达水平 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 心脏组织切片HE染色 |
| 2.2 心肌梗死大鼠心肌组织中miR-221-3p的表达水平 |
| 2.3 miR-221-3p在心肌梗死急性期心肌组织中表达的细胞类型 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第3章 实验第二部分:miR-221-3p对人心脏微血管内皮细胞血管生成能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺氧对人心脏微血管内皮细胞miR-221-3p表达的影响 |
| 2.2 miR-221-3p模拟物和抑制剂转染效果鉴定 |
| 2.3 缺氧条件下过表达 miR-221-3p 抑制人心脏微血管内皮细胞 Ang-2 蛋白的表达 |
| 2.4 缺氧条件下过表达miR-221-3p抑制人心脏微血管内皮细胞增殖 |
| 2.5 缺氧条件下过表达miR-221-3p抑制人心脏微血管内皮细胞成管 |
| 2.6 缺氧条件下过表达miR-221-3p抑制人心脏微血管内皮细胞CD34、IGF1R、IGF-2、VEGFR2 蛋白的表达 |
| 2.7 Ang-2 质粒转染效果鉴定 |
| 2.8 缺氧条件下过表达Ang-2 促进人心脏微血管内皮细胞CD34、IGF1R、IGF-2、VEGFR2 m RNA的表达 |
| 2.9 缺氧条件下过表达Ang-2 促进人心脏微血管内皮细胞CD34、IGF1R、IGF-2、VEGFR2 蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 miR-221和心血管疾病相关性研究 |
| 参考文献 |
（3）基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 眼针对MCAO/R大鼠神经功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 眼针对MCAO/R大鼠缺血侧脑组织血管新生的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 眼针对MCAO/R大鼠脑组织缺血半暗带区域HIF-1α和Wnt3a/β-catenin/LEF1 信号转导通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 一 针刺治疗缺血性脑卒中研究进展 |
| 二 血管新生相关因子及信号传导通路在缺血性脑卒中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）VEGFR2/mTOR/S6K1通路在洛克沙胂促血管生成中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 血管生成及其调节因子 |
| 1.1 血管的生成 |
| 1.2 血管生成的调节因子 |
| 2 VEGF/VEGFR2及其对血管生成的调节 |
| 2.1 VEGF |
| 2.2 VEGFR |
| 2.3 VEGF/VEGFR2对血管生成的调节作用 |
| 2.4 VEGF/VEGFR2相关疾病与靶向治疗 |
| 3 mTOR/S6K1信号及其调节作用 |
| 3.1 mTOR |
| 3.2 S6Ks |
| 3.3 mTOR/S6K1信号的作用 |
| 4 洛克沙胂及其危害 |
| 4.1 洛克沙胂的残留 |
| 4.2 洛克沙胂对动物机体的损伤 |
| 4.3 洛克沙胂与血管生成 |
| 5 目的与意义 |
| 第一章 洛克沙胂对血管内皮细胞及其mTOR/S6K1表达的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 实验设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 大鼠血管内皮细胞的培养 |
| 2.2 细胞处理的分组 |
| 2.3 MTT法检测细胞活性 |
| 2.4 荧光定量RT-PCR检测mTOR和S6K1 |
| 2.5 WB法检测相关蛋白表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 洛克沙胂对血管内皮细胞活力的影响 |
| 3.2 洛克沙胂对mTOR/S6K1蛋白表达的影响 |
| 3.3 洛克沙胂对血管内皮细胞中mTOR、S6K1 mRNA的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 第二章 VEGFR2/mTOR/S6K1在洛克沙胂促血管内皮细胞生长中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞处理的剂量及分组 |
| 2.2 MTT法 |
| 2.3 EdU法检测细胞增殖 |
| 2.4 划痕试验 |
| 2.5 管形成试验(Tube formation assay) |
| 2.6 WB法检测相关蛋白表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 mTOR被抑制后洛克沙胂对血管内皮细胞生长的影响 |
| 3.2 VEGFR2被抑制后洛克沙胂对血管内皮细胞生长的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 洛克沙胂在体内对血管生成及mTOR/S6K1表达的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 溶液配制配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠B16移植瘤模型 |
| 2.2 基质胶塞模型试验 |
| 2.3 HE染色及免疫组化分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 洛克沙胂对小鼠B16移植瘤生长的影响 |
| 3.2 洛克沙胂对基质胶塞血管生成的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 ILT4对非小细胞肺癌血管生成的作用和预后分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4调控非小细胞肺癌血管内皮细胞迁移和血管生成的机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分体内验证ILT4通过诱导血管生成促进肿瘤进展 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述:ILT4和VEGF-A的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（6）单细胞转录组解析人类胚胎造血干细胞与巨核细胞的发育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 早期人胚背主动脉的细胞异质性解析 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.3.1 实验样本的获取 |
| 1.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 人胚背主动脉的解剖分离 |
| 1.4.2 单细胞悬液的制备 |
| 1.4.3 流式细胞分选和10x Genomics建库测序 |
| 1.5 数据分析和处理 |
| 1.5.1 测序原始数据预处理 |
| 1.5.2 表达矩阵降维和细胞聚类 |
| 1.5.3 细胞类型识别和差异表达分析 |
| 1.5.4 细胞群体的相关性分析 |
| 1.6 实验结果 |
| 第二章 人胚生血内皮细胞的富集及其转录组特征分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验样本的获取 |
| 2.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验样本的获取 |
| 2.4.2 流式细胞分选及分析 |
| 2.4.3 STRT-seq建库及测序 |
| 2.5 数据处理和分析 |
| 2.5.1 测序原始数据预处理 |
| 2.5.2 降维和聚类,以及差异分析 |
| 2.5.3 基因表达的相关性分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 内皮细胞中CD44~+和CD44~-群体的分选及特征 |
| 2.6.2 RUNX1~+生血内皮细胞的特征鉴定 |
| 2.6.3 生血内皮细胞的特征基因分析 |
| 第三章 人胚背主动脉造血干祖细胞及内皮造血转化的解析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验样本的获取 |
| 3.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 组织分离,单细胞悬液制备,流式分选和建库 |
| 3.4.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 3.4.3 内皮生血转化假时序分析 |
| 3.4.4 基因表达模式分析 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 人胚背主动脉中造血干祖细胞的转录组异质性 |
| 3.5.2 内皮细胞和造血干祖细胞的联合分析 |
| 3.5.3 内皮造血转化过程及其特征规律 |
| 第四章 极早期胚胎体生血内皮的转录组水平解析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料和分析方法 |
| 4.3.1 实验样本的获取和单细胞建库 |
| 4.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 4.3.3 数据分析方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 人胚极早期发育阶段的细胞异质性解析 |
| 4.4.2 极早期胚胎内皮和造血细胞异质性解析 |
| 4.4.3 极早期生血内皮和背主动脉生血内皮的差异比较 |
| 第五章 人胚早期背主动脉生血微环境的转录组解析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验设计 |
| 5.3 实验材料和分析软件 |
| 5.3.1 数据样本 |
| 5.3.2 分析软件 |
| 5.4 数据分析方法 |
| 5.4.1 配-受体互相作用分析 |
| 5.4.2 配-受体基因的通路富集分析 |
| 5.4.3 细胞群体互作强度的可视化 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 背主动脉生血内皮与微环境细胞群体互作概览 |
| 5.5.2 内皮细胞群体与生血内皮的互作分析 |
| 第六章 人胚早期巨核细胞的异质性解析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验设计 |
| 6.3 实验材料和分析软件 |
| 6.3.1 数据样本 |
| 6.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 6.4 实验和数据分析方法 |
| 6.4.1 卵黄囊和胎肝的单细胞悬液制备 |
| 6.4.2 流式分选和单细胞建库 |
| 6.4.3 测序数据的预处理和质控 |
| 6.4.4 数据批次校正 |
| 6.4.5 降维,聚类和差异分析 |
| 6.4.6 巨核细胞分化假时序分析 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 人胚卵黄囊细胞群体的鉴定 |
| 6.5.2 人胚胎肝细胞群体的鉴定 |
| 6.5.3 巨核细胞群体的鉴定和差异比较 |
| 6.5.4 巨核细胞群体异质性分析 |
| 6.5.5 巨核细胞的分化路径分析 |
| 第七章 结论和展望 |
| 7.1 人类胚胎造血干细胞产生过程的单细胞解析 |
| 7.2 人类胚胎巨核细胞的发育分化规律 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（7）高级别脑胶质瘤新生血管基因特征及生成方式与MR灌注成像相关性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 :高级别脑胶质瘤生长早期血管新生相关基因的表达及PWI-MRI监测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 :原代脑胶质瘤模型与相应患者脑胶质瘤MRI特征及基因表达差异研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 :抗血管治疗后脑胶质母细胞瘤血管新生方式变化的DCE-MRI评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 高级别胶质瘤血管新生研究进展与PWI-MRI评价 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（8）shRNA干扰Vegfr2研究洛克沙胂体内促血管作用及对VEGFR2-mTOR的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 靶向VEGF/VEGFR2治疗的研究进展 |
| 1 VEGF与VEGFR |
| 1.1 VEGF家族 |
| 1.2 VEGF的受体VEGFR |
| 1.3 VEGFVEGFR与临床相关疾病 |
| 2 以VEGF/VEGFR2为靶点的肿瘤治疗 |
| 2.1 以VEGF/VEGFR2为靶点的抗肿瘤天然化合物 |
| 2.2 以VEGF/VEGFR2为靶点的抗肿瘤合成药物 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二部分 正文 |
| 第一章 靶向Vegfr2基因RNA干扰研究洛克沙胂体内促血管生成作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 shRNA对血管内皮细胞VEGFR2的干扰作用 |
| 2.2 靶向Vegfr2基因的shRNA在Rox促小鼠基质胶塞生长中的作用 |
| 2.3 靶向Vegfr2基因的shRNA在Rox促小鼠黑色素移植瘤生长中的作用 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 砷化合物与血管生成 |
| 3.3 关于体内血管生成试验的模型 |
| 3.4 关于靶向Vegfr2基因的RNA干扰 |
| 第二章 洛克沙胂体内促血管生成作用中VEGF/VEGFR2-mTOR的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对基质胶塞中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 2.2 对B16F10移植瘤中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 洛克沙胂体外促血管内皮细胞生长中VEGF/VEGFR2-mTOR的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对内皮细胞活力的影响 |
| 2.2 对内皮细胞中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）斑马鱼cd34家族成员cDNA克隆、发育时序分析及CD34多克隆抗血清制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 CD34家族研究现状 |
| 1.1 CD34的发现 |
| 1.2 PODXL的发现 |
| 1.3 PODXL2的发现 |
| 1.4 CD34家族结构分析 |
| 1.5 CD34功能和应用 |
| 1.6 PODXL功能和应用 |
| 1.7 PODXL2功能和应用 |
| 2 模式生物斑马鱼 |
| 2.1 斑马鱼优势 |
| 2.2 斑马鱼早期发育 |
| 2.3 斑马鱼造血系统 |
| 2.4 斑马鱼人类疾病模型 |
| 3 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 4 实验设计路线 |
| 第二章 斑马鱼cd34家族c DNA克隆和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 总RNA提取及 3’-与 5’-RACE-ready c DNA文库的合成 |
| 1.5 斑马鱼cd34l1、cd34l2、podxl和podxl2基因 3’-RACE和 5’-RACE |
| 1.6 生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 斑马鱼cd34l1、cd34l2、podxl和podxl2的c DNA克隆及序列分析 |
| 2.2 斑马鱼cd34l1、cd34l2、podxl和podxl2基因结构及共线性分析 |
| 2.3 多物种CD34、PODXL和PODXL2氨基酸序列比对 |
| 2.4 CD34家族系统进化树的构建 |
| 3 讨论 |
| 第三章 斑马鱼cd34家族基因的时序表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 半定量RT-PCR |
| 1.5 探针制备 |
| 1.6 原位杂交 |
| 2 结果 |
| 2.1 半定量RT-PCR分析斑马鱼cd34l1、cd34l2、cd34l2-2、podxl和podxl2基因的发育时序表达 |
| 2.2 斑马鱼cd34l1和cd34l2探针质粒的构建 |
| 2.3 全胚原位杂交分析斑马鱼cd34l1和cd34l2基因的表达 |
| 3 讨论 |
| 第四章 斑马鱼CD34L1、CD34L2和CD34L2-2 多克隆抗血清制备及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 斑马鱼cd34l1、cd34l2和cd34l2-2 原核表达载体的构建 |
| 1.5 斑马鱼CD34L1ex、CD34L2ex和CD34L2-2ex融合蛋白的诱导表达及纯化 |
| 1.6 zCD34L1、zCD34L2和zCD34L2-2 多克隆抗血清的制备 |
| 1.7 间接ELISA法检测zCD34L1、zCD34L2和zCD34L2-2 多克隆抗血清的效价 |
| 1.8 Western blot法验证zCD34L1、zCD34L2和zCD34L2-2 抗血清对原核重组蛋白的识别 |
| 1.9 斑马鱼cd34l1、cd34l2和cd34l2-2 真核表达载体的构建 |
| 1.10 Odyssey Western blot法验证zCD34L1、zCD34L2和zCD34L2-2 抗血清对真核表达蛋白的识别 |
| 2 结果 |
| 2.1 斑马鱼cd34l1、cd34l2和cd34l2-2 原核表达载体的构建 |
| 2.2 zCD34L1ex、zCD34L2ex和zCD34L2-2ex融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 zCD34L1、zCD34L2和zCD34L2-2 兔源多克隆抗血清的制备及效价检测 |
| 2.4 zCD34L1、zCD34L2和zCD34L2-2 兔源多克隆抗血清对原核表达的重组蛋白的识别检测 |
| 2.5 斑马鱼cd34l1、cd34l2和cd34l2-2 真核表达载体的构建 |
| 2.6 zCD34L1、zCD34L2和zCD34L2-2 兔源多克隆抗血清对真核表达蛋白的识别检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（10）MiR-526b-3p在阿霉素引起的血管内皮细胞损伤中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-526b-3p在阿霉素引起的微血管和心脏功能损伤中的作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiR-526b-3p在阿霉素引起的HUVEC损伤中的作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 VEGFA在miR-526b-3p引起的HUVEC损伤中的作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 MiR-526b-3p对VEGFA调控作用的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 阿霉素与心脏毒性 |
| 参考文献 |
| 发表的论文 |
| 申报的课题 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
四、CD34基因与血管内皮细胞（论文参考文献）
- [1]MAPK4通过调节内皮细胞增殖促进非小细胞肺癌体内生长的研究[D]. 陈静. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]从血管新生方向探讨miR-221-3p对心肌梗死保护作用的机制研究[D]. 杨青. 南昌大学, 2021(01)
- [3]基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制[D]. 浦延鹏. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [4]VEGFR2/mTOR/S6K1通路在洛克沙胂促血管生成中的作用[D]. 张蒙. 扬州大学, 2021(02)
- [5]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
- [6]单细胞转录组解析人类胚胎造血干细胞与巨核细胞的发育[D]. 贺健. 军事科学院, 2021(02)
- [7]高级别脑胶质瘤新生血管基因特征及生成方式与MR灌注成像相关性研究[D]. 薛巍. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [8]shRNA干扰Vegfr2研究洛克沙胂体内促血管作用及对VEGFR2-mTOR的影响[D]. 韦芊含. 扬州大学, 2020(01)
- [9]斑马鱼cd34家族成员cDNA克隆、发育时序分析及CD34多克隆抗血清制备[D]. 成艳桃. 山西大学, 2020
- [10]MiR-526b-3p在阿霉素引起的血管内皮细胞损伤中的作用机制研究[D]. 张丽芙. 苏州大学, 2020(06)