IL-12和IL-2联合基因治疗大鼠肝癌的研究

一、白细胞介素12及白细胞介素2对大鼠肝癌的联合基因治疗研究（论文文献综述）

赵青^[1]（2014）在《白藜芦醇对肿瘤自杀基因系统的增效作用》文中提出目的本课题研究将对已确定对自杀基因系统具有协同增效作用的白藜芦醇这一中药活性成份进行研究,探究其如何通过缝隙连接细胞通讯增强自杀基因的旁杀伤效应,为建立中医药治疗肿瘤,推进抗癌中药新药和肿瘤基因治疗的临床应用打下基础。方法本实验以体外培养的大鼠肝癌细胞CBRH7919, CBRH7919TK,小鼠恶性黑色素瘤B16-RFP, B16/TK-GFP作为研究对象。大鼠肝癌自杀基因系统运用MTT法检测白藜芦醇对其的增效作用,确定作用时间及药物浓度；Western Blot检测白藜芦醇对缝隙连接蛋白,其中包括Cx26、Cx32和Cx43表达的影响；用裸小鼠体内实验验证白藜芦醇对大鼠肝癌自杀基因系统的增效作用。小鼠恶性黑色素瘤自杀基因（带绿色荧光）细胞运用MTT法检测白藜芦醇对其的协同增效作用,确定作用时间及药物浓度；流式细胞仪技术检测白藜芦醇对其凋亡作用影响；Western Blot法检测白藜芦醇对缝隙连接蛋白,其中包括Cx26、Cx32和Cx43表达的影响；成果一、白藜芦醇对小鼠恶性黑色素瘤自杀基因系统的增效作用（一）白藜芦醇对30%B16tk-GFP/GCV的增效作用用4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L的白藜芦醇作用30%B16/TK-GFP细胞72h后,其细胞抑制率分别为-3.43±3.03%,-1.88±1.29%、26.65±1.87%、36.95±3.23%；4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L的白藜芦醇联合作用30%B16TK-GFP/GCV细胞72h后,其细胞抑制率分别为43.32±3.93%、47.00±4.13%、53.74±4.61%、55.76±3.83%,金氏Q值分别是1.98、2.04、1.21、1.06,除了32μmol/L与30%B16TK-GFP/GCV联合属于相加效应之外,其他浓度均为协同效应。（二）用流式细胞仪检测白藜芦醇对30%B16/TK-GFP的凋亡作用白藜芦醇单药作用于30%B16/TK-GFP时,亚倍体凋亡峰Sub-G1峰由细胞对照的3.00%增加到4.15%,5.26%,6.96%,白藜芦醇16μmol/L时与对照组相比,P<0.05,有显着性差异。联合GCV后,亚倍体凋亡峰即Sub-G1峰由单独GCV作用的6.63%增加到8.96%,11.32%,15.24%,白藜芦醇8μmol/L,16μmol/L时与GCV组相比,P<0.01,有显着性差异,与对应浓度的Res组相比P<0.01,有显着性差异。计算金氏Q值后,Q值都大于1.15,具有协同作用。可以看出,白藜芦醇与GCV联合作用于自杀基因时,其具有一定的协同作用。（三） Western Blot检测白藜芦醇对B16-RFP细胞株中Cx26、Cx32和Cx43缝隙蛋白表达的影响白藜芦醇作用B16-RFP细胞48h后检测Cx26蛋白有升高的趋势；Cx32蛋白表达统计无显着性差异；Cx43蛋白升高的趋势。二、白藜芦醇对大鼠肝癌自杀基因系统的增效作用（一）白藜芦醇对20%CBRH7919TK/GCV的增效作用用2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、的白藜芦醇作用20%CBRH7919tk细胞48h后,其细胞抑制率分别为-0.43±1.77%,-0.85±0.58%、0.64±1.00%、9.75±1.45%、12.63±2.17%;2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的白藜芦醇联合作用20%CBRH7919TK/GCV细胞48h后,其细胞抑制率分别为13.43±1.66%、14.02±1.92%、19.40±3.61%、24.15±2.84%、21.37±2.69%,金氏Q值分别是1.31、1.56、1.87、1.29、1.01。除了40μmol/L与20%CBRH7919TK/GCV联合属于相加效应之外,其他浓度均为协同效应。（二） Western Blot检测白藜芦醇对CBRH7919细胞株中Cx26、Cx32和Cx43缝隙蛋白表达的影响白藜芦醇作用48h后检测CBRH7919细胞Cx26蛋白的表达是呈上升的趋势；Cx32蛋白的表达有上升的趋势；Cx43蛋白表达有上升趋势。（三）白藜芦醇在体内联合50%TK/GCV系统对CBRH7919的增效作用白藜芦醇100mg/kg肿瘤质量比模型组大、白藜芦醇150mg/kg组的肿瘤质量比模型组小,两对均没有统计学意义（P>0.05）；白藜芦醇100mg/kg联合GCV组、白藜芦醇150mg/kg联合GCV组和GCV组与模型组比较有统计学意义（P<0.05）；白藜芦醇100mg/kg联合GCV组与GCV组相比无统计学意义（P>0.05）,白藜芦醇150mg/kg联合GCV组与GCV组比较有统计学意义（P<0.05）；联合组与对应浓度白藜芦醇组相比较有统计学意义（P<0.05）。结论本文在前期实验的基础上,用中药活成分白藜芦醇对小鼠恶性黑色素瘤和大鼠肝癌这两个自杀基因系统进一步探讨,发现白藜芦醇可以提高自杀基因系统的增效作用,通过调节缝隙连接蛋白,来增强GJIC的功能。

郑和鸣^[2]（2007）在《逆转录病毒介导人白介素-2基因转染肝干细胞的实验研究》文中研究指明肝脏恶性肿瘤的治疗在经历手术、放疗、化疗之后，免疫基因治疗已经成为肿瘤治疗领域的热点，现在治疗的热点主要集中在以细胞因子为目的基因的免疫基因治疗。细胞因子在肝癌的抗肿瘤治疗中的作用已经是有目共睹的：细胞因子可作为恶性肿瘤生长的直接调节剂，杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞，通过作用于肿瘤的血管和营养供应系统影响宿主／肿瘤关系，激发宿主对肿瘤的免疫反应。目前应用细胞因子进行肿瘤免疫治疗的动物实验已经取得了非常显着的效果，已有越来越多的细胞因子治疗方式引入临床实践中，人们进行了在体外用IL-2诱生自体LAK细胞，然后回输到患者体内治疗恶性肿瘤的尝试，这一疗法在某些肿瘤患者取得了使肿瘤缩小的效果。但是，临床实验中发现，给人体反复应用重组IL-2可产生多种副作用。因而我们发现在肝癌肿瘤组织的局部持续地高浓度地给予细胞因子，能使细胞因子发挥最大的抗肿瘤效应，使其的副作用减到最小。目前，肝癌免疫基因治疗的研究结果尚不能令人满意，主要的原因是缺乏良好的基因转移载体。因而，选择一个良好的基因转移载体是实现肝癌免疫基因治疗的关键所在。近年来，随着干细胞研究的深入，发现干细胞具有自我更新和多潜能分化的双重特性，加之易于采集、回输，是基因治疗理想的靶细胞，从而出现了免疫基因治疗与干细胞治疗相结合的应用研究。将外源性基因导入干细胞的研究近年开始增多，其目的主要有：①促进干细胞分化：②作为基因治疗细胞载体；③干细胞基因修饰后增强某基因表达，对其进行功能改造以适应治疗的需要。肝干细胞较肝细胞有着更强的增殖能力，在体内外均有极强的向肝系细胞分化的能力，目前成为治疗肝脏疾病的理想载体细胞。本研究通过RT-PCR从人体周围静脉血中扩增IL-2全长编码序列，并将其克隆至PET-32a原核表达载体中，转化大肠杆菌BL-21。经IPTG诱导表达，产生融合蛋白。同时采用DNA重组技术，构建了重组逆转录病毒载体Plpcx-EGFP、Plpcx-IL-2-EGFP及Plpcx-IL-2，并研究其在包装细胞PT67中的表达。然后，通过逆转录病毒介导人白介素-2基因转染而建立稳定高效表达的肝干细胞WB-F344，为下一步开展研究以肝干细胞为载体肝癌免疫基因治疗的动物实验打下基础。第一部分人白细胞介素-2 cDNA的克隆及原核载体的构建及其表达目的：通过RT-PCR从人体周围静脉血中扩增IL-2全长编码序列，并构建重组原核表达载体PET-32a-IL-2，并在大肠杆菌BL21中表达。方法：分离健康人外周静脉血单核巨噬细胞，通过细胞总RNA的提取、RT-PCR从人体周围静脉血中扩增IL-2全长编码序列，并将其克隆至T载体中。测序，并利用DNAStar软件对所测定的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、分析。将IL-2全长编码序列克隆至PET-32a-IL-2原核表达载体，转化大肠杆菌BL-21，经IPTG诱导表达，并经10％SDS-PAGE凝胶电泳、考马斯亮蓝染色及Westen blot鉴定。结果：正确扩增出人IL-2全长编码序列，测序结果正确，并分析了人白介素-2的蛋白结构。正确构建了重组原核表达质粒PET-32a-IL-2，测序结果正确，并在大肠杆菌中高效表达。结论：扩增出的人IL-2和文献报道的cDNA序列一致，并构建重组原核表达质粒PET-32a-IL-2。第二部分携带人IL-2基因重组逆转录病毒载体的构建及其在PT67细胞中的包装目的：构建人白介素-2基因的逆转录病毒体系Plpcx-EGFP、Plpcx-IL-2-EGFP及Plpcx-IL-2，并研究其在包装细胞PT67中的表达。方法：采用DNA重组技术，将pEGFP-N1质粒用EcoRI和NotI进行双酶切，获得EGFP cDNA片段，与用同样酶切的Plpcx载体在Ligation Mix连接酶的作用下进行连接反应，构建成重组逆转录病毒表达载体Plpcx-EGFP。酶切鉴定，测序证实。以PET-32a-IL-2为模板，通过PCR扩增IL-2全长编码序列，BamHI和EcoRI双酶切后将该片段克隆至Plpcx-EGFP，构建成重组逆转录病毒表达载体Plpcx-IL-2-EGFP，酶切鉴定，测序证实。采用DNA重组技术，将PET-32a-IL-2质粒用BglⅡ和NotⅠ进行双酶切，获得IL-2 cDNA片段，与用同样酶切的Plpcx载体在Ligation Mix连接酶的作用下进行连接反应，构建成重组逆转录病毒表达载体Plpcx-IL-2。酶切鉴定，测序证实。用Lipofectamine2000介导Plpcx-EGFP转染入逆转录病毒包装细胞PT67中，观察转染效率。用Lipofectamine 2000介导Plpcx-IL-2-EGFP和Plpcx-IL-2转染入逆转录病毒包装细胞PT67中，经嘌呤霉素筛选后，并用NIH3T3细胞测定病毒滴度，获得高滴度的抗性克隆，命名为PT67／Plpcx-IL-2-EGFP及PT67／Plpcx-IL-2。结果：（1）构建的Plpcx-EGFP重组载体经酶切鉴定后有约6.3kb的载体片段和780bp的EGFP片段，构建的Plpcx-IL-2-EGFP重组载体经酶切鉴定后有780bp的EGFP片段，构建的Plpcx-IL-2重组载体经酶切鉴定后有462bp的IL-2片段，三种重组载体皆经测序进一步证实。（2）筛选PT67／Plpcx-IL-2-EGFP及PT67／Plpcx-IL-2细胞抗性克隆，其病毒滴度达105CFU／ml。结论：成功构建了携带人IL-2基因的逆转录病毒载体Plpcx-EGFP、Plpcx-IL-2-EGFP及Plpcx-IL-2，建立的逆转录病毒系统PT67／Plpcx-IL-2-EGFP及PT67／Plpcx-IL-2能产生高滴度的病毒颗粒，为下一步感染肝干细胞WB-F344奠定了基础。第三部分稳定表达人白介素-2的肝干细胞系的建立目的：通过逆转录病毒介导人白介素-2基因转染而建立稳定高效表达的肝干细胞WB-F344。方法：（1）选用高滴度的PT67／Plpcx-IL-2-EGFP和PT67／Plpcx-IL-2病毒液进行肝干细胞WB-F344的感染，经嘌呤霉素筛选，获得抗性克隆，命名为WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2；（2）分别用基因组PCR、RT-PCR和Western blot、间接免疫荧光试验、细胞免疫组化检测WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2人白介素-2基因整合入细胞基因组及细胞内人白介素-2的表达的情况。结果：（1）嘌呤霉素筛选WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2细胞抗性克隆生长良好。（2）Western blot检测的WB-F344／Plpcx-IL-2细胞可见有15kD的特异条带，证明有白介素-2的表达；基因组PCR和RT-PCR均显示有与预期结果一致的462bp的条带，证实WB-F344／Plpcx-IL-2细胞有IL-2基因整合及mRNA表达。间接免疫荧光试验、细胞免疫组化均证实人IL-2蛋白在WB-F344／Pipcx-IL-2细胞中的表达。结论：构建能稳定表达人白介素-2的肝干细胞系WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2，为下一步开展研究以肝干细胞为载体肝癌免疫基因治疗的动物实验打下基础。结论：1．正确扩增出人IL-2全长编码序列，测序，并利用DNAStar软件对所测定的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析。2．正确构建了重组原核表达质粒PET-32a-IL-2，测序结果正确，并在大肠杆菌中高效表达了融合蛋白。3．成功构建了携带人IL-2基因的逆转录病毒载体Plpcx-EGFP、Plpcx-IL-2-EGFP及Plpcx-IL-2。4．建立的逆转录病毒系统PT67／Plpcx-IL-2-EGFP及PT67／Plpcx-IL-2能产生具有感染性的病毒颗粒。5．成功构建能稳定表达人白介素-2的肝干细胞WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2，为下一步开展研究以肝干细胞为载体肝癌免疫基因治疗的动物实验打下基础。

闫芳,李宪超^[3]（2005）在《白细胞介素18及其基因的应用研究进展》文中进行了进一步梳理

范瑞芳,杨家和,柴福录,卫立辛,吴孟超,钱其军,尤天庚,薛惠斌^[4]（2005）在《脾内转染人IL-2与鼠IL-12融合基因对大鼠诱发肝癌的治疗作用》文中提出目的研究脾内注射携带人白细胞介素2（hIL-2）与鼠白细胞介素12（mIL1-2）融合基因的逆转录病毒包装细胞株对大鼠诱发肝细胞癌的生长抑制作用。方法构建携带hIL-2和mIL-12融合基因的逆转录病毒载体GCIL1-2EIL-2PN,转染包装细胞PA317后,分别在大鼠肝癌诱发后90天（早期治疗组）及105天（晚期治疗组）进行脾内注射治疗,观察大鼠生存时间及毒性反应。ELISA法检测大鼠血清IL-12和IL-2浓度,放射性活度测定法检测脾脏NK细胞活性。结果IL-12+IL-2联合基因治疗组中,早期治疗及晚期治疗的生存时间分别为188.1±14.2天及168.5±13.6天;IL-12基因治疗组分别为168.2±13.4天及149.1±13.8天（与联合基因治疗组相比,P<0.01）;IL-2基因治疗组分别为145.9±11.3天及131.1±10.5天（P<0.01）。3个治疗组中,早期治疗的平均生存时间均长于晚期治疗（P<0.01）。IL-12+IL-2联合基因治疗组中,早期治疗后长期存活率（≥240天）为25%（5/20）,治疗后5天肝癌组织中浸润的淋巴细胞明显增多,治疗后2个月血清hIL-2及mIL-12仍维持在较高水平。各基因治疗组NK细胞活性较对照组显着增高（P<0.01）。IL-12+IL-2联合基因组NK细胞活性明显高于单基因治疗组（P<0.01）。结论脾内直接注射携带hIL-2和（或）mIL-12基因的逆转录包装细胞株可显着提高NK细胞的活性,抑制?

杨家和,范瑞芳,钱其军,尤天庚,薛惠斌,苏长青,曹惠芳,吴孟超^[5]（2003）在《逆转录病毒介导白细胞介素12及白细胞介素2基因联合治疗大鼠肝癌》文中研究指明目的 :研究携带小鼠白细胞介素 12 （m IL- 12 ）和人白细胞介素 2 （h IL- 2 ）基因的逆转录病毒包装细胞株对大鼠肝癌进行联合基因治疗的可行性和疗效。 方法 :构建携带 m IL- 12基因、h IL- 2基因及 m IL- 12 +h IL- 2基因的逆转录病毒包装细胞PA317- GCIL12 EXPN、PA317- GCXEIL2 PN和 PA317- GCIL12 EIL2 PN,分别与肝癌细胞 CBRH3以 1∶ 1混合接种于大鼠腹腔。观察其生存时间。 结果 :生理盐水对照组、空载体对照组 （PA317- GCXEXPN）和 h IL - 2治疗组的平均生存时间分别为（8.5± 1.2 ） d、（8.3± 0 .9） d和 （16 .7± 1.7） d;m IL - 12治疗组和 m IL - 12 +h IL - 2治疗组均长期存活。逆转录病毒包装细胞与CBRH3的比例为 1∶ 10 0混合时 ,m IL - 12 +h IL - 2治疗组仍能长期存活 ,而 m IL - 12治疗组平均生存时间为 （15 .7± 1.8） d。腹腔接种 CBRH3后 1、3、5、7d,采用 m IL- 12 +h IL- 2治疗后 35 d生存率分别为 10 0 %、10 0 %、30 %、15 %。 结论 :携带 m IL- 12和 h IL - 2基因的逆转录包装细胞株可明显抑制肝癌细胞的生长 ,早期治疗优于晚期治疗 ,联合基因治疗比单基因治疗更有效

杨家和,范瑞芳,钱其军,尤天庚,薛惠斌,苏长青,曹惠芳,吴孟超^[6]（2003）在《脾内转染白细胞介素12与白细胞介素2融合基因治疗肝癌的实验研究》文中研究指明目的 观察脾内直接注射携带白细胞介素 12与白细胞介素 2融合基因的逆转录病毒包装细胞株对肝癌细胞的生长抑制作用。方法 构建携带小鼠白细胞介素 12 （mIL 12 ）和人白细胞介素 2 （hIL 2 ）融合基因的逆转录病毒载体GCIL12EIL2PN ,转染包装细胞PA317,于不同时间对接种肝癌大鼠模型进行脾内注射 （1× 10 7细胞 /只 ）治疗 ,观察对肝癌细胞的生长抑制作用及其对大鼠的免疫功能变化、毒性反应。结果 IL 12 IL 2融合基因治疗组中 ,肝癌细胞株CBRH3接种大鼠肝脏后第 1、3、5、7天进行治疗的大鼠平均生存时间分别为 5 3 3d± 3 7d、4 9 3d± 4 2d、31 0d± 2 1d及 2 4 3d±1 4d ,IL 2基因治疗组分别为 2 5 0d± 2 5d、2 3 5d± 2 0d、18 3d± 2 4d及 12 0d± 1 8d（P <0 0 0 1） ,IL 12基因治疗组分别为 39 0d± 4 8d、32 0d± 3 9d、2 3 0d± 2 5d及 19 4d± 2 1d（P <0 0 0 1）。第 1天和第 3天治疗组长期存活率 （≥ 6 0d）为 30 % ,治疗后 2个月血清mIL 12及hIL 2仍维持在较高水平。治疗后肝癌组织中浸润的淋巴细胞明显增多。结论 脾内直接注射携带mIL 12和hIL 2融合基因的逆转录包装细胞株可明显抑制肝癌细胞的生长 ,早期治疗优于晚期治疗。

杨家和,范瑞芳,钱其军,尤天庚,薛惠斌,苏长青,曹惠芳,吴孟超^[7]（2002）在《白细胞介素12及白细胞介素2对大鼠肝癌的联合基因治疗研究》文中研究指明目的:研究利用小鼠白细胞介素12（mIL-12）和人白细胞介素2（hIL-2）基因对大鼠肝癌进行联合基因治疗的可行性和疗效。方法:构建携带mIL-12和hIL-2基因的逆转录病毒载体,转染包装细胞后对实验性肝癌大鼠进行肝癌局部注射,观察对肝癌细胞的生长抑制作用及其对大鼠的免疫功能变化、毒性反应。结果:携带mIL-12/hIL-2基因的重组逆转录病毒在肿瘤内局部注射明显抑制了肝肿瘤的生长。肝癌接种后第1,3,5,7天治疗组大鼠35d生存率分别为100％,100％,30％,10％。IL-12+IL-2治疗组平均生存时间明显高于生理盐水对照组（P<0.01）、逆转录病毒空载体对照组（P<0.01）、IL-2治疗组（P<0.01）和IL-12治疗组（P<0.05）。治疗后肝癌组织中浸润的淋巴细胞明显增多。结论:肝癌局部注射携带mIL-12和hIL-2基因的逆转录包装细胞株可明显抑制肝癌细胞的生长,早期治疗优于晚期治疗。

周瑶^[8]（2010）在《六味地黄丸入血成分及山奈酚对自杀基因系统杀伤肝癌细胞的增效作用》文中认为一、研究目的及意义原发性肝癌（以下简称肝癌）是世界范围内尤其是我国常见的恶性肿瘤之一,预后差,复发和死亡率高,患者生存质量差。肿瘤的基因治疗作为一种新的治疗理念,一经出现就引起肝癌研究人员的高度重视。随着分子生物学的发展,肝癌的基因治疗尤其是自杀基因治疗为患者带来了希望,但单纯自杀基因治疗,由于目前载体转染效率较低、靶向性不够等问题没解决,仍有部分肿瘤细胞残余导致肿瘤复发,这是该疗法存在的重大缺陷。旁观者效应即转染基因的阳性细胞对未转染基因的阴性细胞的杀伤效应是自杀基因治疗的显着特点,因而增强旁观者效应目前已成为提高肿瘤自杀基因治疗疗效的重要策略。前期研究表明：体内体外实验中六味地黄丸对自杀基因系统治疗肿瘤均具有明显的增效作用,其增效作用与免疫机制和缝隙连接机制相关。六味地黄丸对肿瘤自杀基因疗法增效作用的药效物质基础是什么?其增效作用的机制如何?本实验拟通过体外实验六味地黄丸主要入血成分入手对其进行论证。并在前期研究的基础之上继续筛选对自杀基因疗法有确切增效作用的中药活性成分。通过研究以期为临床自杀基因疗法联合中药复方和单体的中西医结合治疗方案的建立提供实验数据和科学依据。二、研究方法：1.六味地黄丸主要入血成分对CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗的影响：按CBRH7919/tk占总细胞数10%的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,用适当终浓度的各入血成分单体及单体混合成分与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919／tk细胞,各入血成分单体的终浓度分别为：①丹皮酚／马钱素／混合成分：25、50、100 u M；②莫诺苷／5-羟甲基-2-糠酸／獐牙菜苷：37.5、75、150μM。MTT法检测各组细胞的抑制率,用金正钧Q值分析各入血成分与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。2.六味地黄丸主要入血成分混合组分淋巴细胞培养上清液的制备及对CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗增效作用的量效关系：SPF级健康雄性SD大鼠,消毒室剖腹取脾,制备脾淋巴细胞悬液,与药物混合组分共同培养72h,制成含药上清；不加药物混合组分培养72h,制成空白上清。按CBRH7919/tk占总细胞数10%的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,用7.5%、15%、30%的含药上清和空白上清与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919／tk细胞,MTT法检测各组细胞的抑制率,用金正钧Q值分析含药上清和空白上清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。3.含药淋巴细胞培养上清对大鼠肝癌细胞自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制：设7.5%含药上清组、15%含药上清组、7.5%空白上清组、15%空白上清组,WesternBlot法检测含药上清和空白上清对CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响；设置对照组、7.5%含药上清组、15%含药上清组、7.5%含药上清联合GCV组、15%含药上清联合GCV组、7.5%含药上清联合GCV+30μM甘草次酸组、7.5%含药上清联合GCV+60μM甘草次酸组、15%含药上清联合GCV+30μM甘草次酸组、15%含药上清联合GCV+60μM甘草次酸组、单独GCV组、GCV+30μM甘草次酸组、GCV+60μM甘草次酸组。GCV的终浓度为15.7μM,MTT法检测各组细胞的抑制率,观察GJIC抑制剂甘草次酸对含药上清联合tk/GCV系统对CBRH7919细胞杀伤作用的影响。4.山奈酚对CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗增效作用的量效关系：按CBRH7919/tk占总细胞数10%的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,设置对照组、15μM山奈酚组、30 u M山奈酚组、60μM山奈酚组、GCV组、15μM山奈酚联合GCV组、30μM山奈酚联合GCV组、60μM山奈酚联合GCV组,GCV的终浓度为15.7μM,MTT法检测各组细胞的抑制率,用金正钧Q值分析山奈酚与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。5.山奈酚对大鼠肝癌细胞自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制：设对照组、15μM山奈酚组、30μM山奈酚组、60μM山奈酚组,细胞接种荧光示踪法测定山奈酚对CBRH7919细胞GJ功能的影响；RT-PCR法检测山奈酚对CBRH7919细胞Cx43mRNA的影响：Western Blot法检测山奈酚对CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响。设置对照组、20μM山奈酚组、40μM山奈酚组、20μM山奈酚联合GCV组、40μM山奈酚联合GCV组、20μM山奈酚联合GCV+30μM甘草次酸组、20μM山奈酚联合GCV+60μM甘草次酸组、40μM山奈酚联合GCV+30μM甘草次酸组、40μM山奈酚联合GCV+60μM甘草次酸组、单独GCV组、GCV+30μM甘草次酸组、GCV+60μM甘草次酸组。GCV的终浓度为15.7μM,MTT法检测各组细胞的抑制率,观察GJIC抑制剂甘草次酸对山奈酚联合tk/GCV系统对CBRH7919细胞杀伤作用的影响。6.采用流式细胞技术和彗星电泳实验检测山奈酚联合CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗对癌细胞周期并分析其对凋亡指数的影响：按CBRH7919/tk占总细胞数10%的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,设置对照组、15μM山奈酚组、30μM山奈酚组、60μM山奈酚组、GCV组、15μM山奈酚联合GCV组、30μM山奈酚联合GCV组、60μM山奈酚联合GCV组, GCV的终浓度为15.7μM,流式细胞技术分析各组细胞周期相和各组细胞凋亡指数；彗星电泳实验通过观察其平均光密度值和彗星尾距以分析山奈酚联合tk/GCV系统治疗对癌细胞凋亡的影响。三、研究结果1.六味地黄丸主要入血成分对CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗的影响：25μM、50μM、100μM丹皮酚分别联合10%tk/GCV组的实际抑制率（17.23%、17.89%、18.46%）低于理论抑制率（19.73%、21.10%、22.75%）,金正均Q值分别为0.87、0.85、0.81,均小于1.15,为相加作用；25μM、50μM、100μM马钱素分别联合10%tk/GCV组的实际抑制率为13.17%、13.86%、12.22%,理论抑制率为14.01%、12.15%、12.84%,金正均Q值分别为0.94、1.14、0.95,均小于1.15,为相加作用；75μM莫诺苷联合GCV后细胞抑制率与相应浓度莫诺苷组极为接近,37.5μM、150μM莫诺苷分别联合GCV后细胞抑制率较相应浓度莫诺苷组反而降低,不具有协同增效作用；37.5μM、75μM、150μM5-羟甲基-2-糠酸分别联合10%tk/GCV组的实际抑制率（3.00%、2.71%、1.01%）低于理论抑制率（5.45%、5.86%、2.48%）,金正均Q值分别为0.55、0.46、0.41,均小于0.85,为拮抗作用；37.5μM獐牙菜苷联合GCV组的细胞抑制率为-3.22%,与空白对照组比较为细胞增殖作用,75μM、150μM獐牙菜苷联合10%tk/GCV组的实际抑制率（7.47%、2.88%）接近理论抑制率（7.25%、2.72%）,金正均Q值分别为1.03、1.06,均小于1.15,为相加作用：25μM、50μM、100μM混合成分联合10%tk/GCV组的实际抑制率（4.06%、5.44%、7.37%）低于理论抑制率（14.65%、14.07%、11.13%）,金正均Q值分别为0.28、0.39、0.66,均小于0.85,为拮抗作用。2.六味地黄丸主要入血成分混合组分淋巴细胞培养上清液的制备及其对CBRH7919细胞株tk/GCV系统增效作用的量效关系：7.5%、15%、30%空白上清联合10%tk/GCV组的实际抑制率（10.49%、13.16%、19.94%）低于理论抑制率（12.43%、15.33%、21.42%）,金正均Q值分别为0.85、0.86、0.93,均小于1.15、大于等于0.85,为相加作用；7.5%、15%、30%含药上清联合10%tk/GCV组的实际抑制率（22.72%、26.68%、30.50%）显着高于理论抑制率（15.18%、15.27%、13.64%）,金正均Q值分别为1.50、1.75、2.24,均大于1.15,具有协同增效作用。3.含药淋巴细胞培养上清对大鼠肝癌细胞自杀基因系统增效作用的缝隙连接（GJ）机制：空白上清不能提高Cx43蛋白的表达,含药上清对Cx43蛋白表达可能具有双向调节作用,高浓度的含药上清能提高Cx43蛋白的表达,低浓度则抑制其表达。7.5%含药上清联合GCV在30μM GA（甘草次酸,GJ抑制剂）阻断后细胞抑制率（27.32%）低于GA阻断前（27.83%）（P>0.05）；7.5%含药上清联合GCV在60μMGA阻断后细胞抑制率（29.56%）高于GA阻断前（27.83%）（P>0.05）；15%含药上清联合GCV在30μM和60μMGA阻断后细胞抑制率（31.40%、24.79%）与GA阻断前（34.09%）相比降低（30μMGA阻断时P>0.05；60μMGA阻断时P<0.01）,提示含药上清对CBRH7919细胞GJ功能可能具有双向调节作用,高浓度时具有促进作用；含药上清对大鼠肝癌细胞自杀基因治疗系统的增效作用与缝隙连接机制有关。4.山奈酚对CBRH7919细胞株tk/GCV系统增效作用的量效关系：15μM、30μM、60μM山奈酚联合10%tk/GCV组的实际抑制率（23.44%、28.75%、53.81%）显着高于理论抑制率（15.34%、18.52%、43.58%）,金正均Q值分别为1.53、1.55、1.24,均大于1.15,具有协同增效作用。5.山奈酚对大鼠肝癌细胞自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制：山奈酚能促进CBRH7919细胞的GJ功能,且呈量效依赖关系；山奈酚对CBRH7919细胞Cx43 mRNA和蛋白的表达具有促进作用,且具有量效依赖关系；20μM、40μM山奈酚联合GCV在30μM和60μMGA阻断后细胞抑制率（26.74%、39.55%；24.62%、32.93%）与GA阻断前（45.06%；55.11%）相比明显降低（P<0.01）。6.采用流式细胞技术和彗星电泳实验检测山奈酚联合CBRH7919细胞株tk/GCV系统治疗对癌细胞周期并分析其对凋亡指数的影响：山奈酚联合GCV后细胞周期S期阻滞率大幅提高,15、30、60μM的山奈酚联合GCV组的凋亡率（13.88%、24.06%、38.23%）明显高于15、30、60μM的山奈酚组（8.94%、13.53%、17.80%）和单独GCV组（15.44%）；彗星电泳实验显示15、30、60μM的山奈酚联合GCV后较单纯中药组和单独GCV组细胞核平均光密度值明显降低、彗星尾距显着增加。四、结论本研究初步证实从六味地黄丸的主要入血成分中分离得到的五种化合物及五种化合物的混合成分与六味地黄丸对肿瘤自杀基因疗法的增效作用无直接的药效关系,含药淋巴细胞培养上清对CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统治疗具有协同增效作用,其增效作用可能与缝隙连接机制有关；初步筛选出可提高CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统治疗旁观者效应的中药活性成分山奈酚,其增效作用可能与缝隙连接机制和细胞凋亡机制有关,进一步研究表明可能是通过提高Cx43表达、诱导凋亡、调节细胞周期而共同达到协同增效作用。

夏向文^[9]（2010）在《动脉内IL-12基因治疗联合化疗栓塞术治疗肝癌的实验研究》文中提出目的构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和人白细胞介素12双亚基目的基因（hIL-12,P35,P40）的真核表达质粒pEGFP-C1IL-12,研究其体外抗肿瘤作用。分离、纯化白芨多糖,制备阳离子型白芨多糖,研究其表征,探讨其在体内外作为基因递送载体的可行性研究动脉内白细胞介素12基因治疗联合化疗栓塞术治疗VX2肝癌的抗肿瘤及抗肿瘤血管生成的疗效,探讨其可能的机制。材料与方法提取脂多糖（LPS）诱导后的人脐带血淋巴细胞总RNA,RT-PCR法扩增人白细胞介素12的双亚基P35和P40的全长cDNA,采用重叠PCR法连接两个亚基,双酶切双亚基片段及载体pEGFP-C1,T4DNA连接酶连接,重组质粒转化大肠埃希菌,挑取阳性克隆,PCR、双酶切及测序鉴定。借助脂质体将重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过荧光显微镜检测报告基因的表达,RT-PCR及Western blot去检测目的基因的表达。MTT法检测肝癌细胞的生长情况,RT-PCR法检测肝癌细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的变化。经热水抽提,乙醇沉淀,Sevag法脱蛋白,经阴离子交换纤维素柱（DE-52）和凝胶柱（Sephadex G-100）层析,分离纯化得白芨多糖,通过高碘酸钾氧化得到含醛基的还原性多糖,该还原性多糖与精胺在碱性条件下形成希夫碱式共轭物,经硼氢化钠还原得含伯胺基的阳离子型多糖,分别通过盐酸羟胺法和三硝基苯磺酸法测醛基与伯胺基的产量。考察氧化反应时间对反应产物的影响。运用琼脂糖凝胶电泳检测该阳离子型多糖对基因的结合与保护作用。将阳离子型白芨多糖载基因复合物与体外生长的肝癌细胞系HepG2共培养,研究转染效率。进一步通过介入途径经肝动脉导入复合物,以GFP作为报告基因检测复合物在体内对活体兔肝组织细胞的转染,同时检测其血清转氨酶水平及肾功能指标以评估体内毒性。32只生长有VX2肝癌的新西兰大白兔随机分为四组,每组八只,开腹后使用自制穿刺针置入肝动脉行介入治疗。A组行生理盐水灌注（对照组）,B组行常规化疗栓塞,C组行动脉内基因灌注治疗,D组行动脉内基因灌注治疗+化疗栓塞。治疗前及治疗后第14天行螺旋CT扫描检测肿瘤大小,计算肿瘤相对生长速率；于治疗前及治疗后第3、7、14天采静脉血检测循环血中IFN-γ的水平；于第14天处死所有实验兔,免疫组化法检测瘤组织VEGF表达水平、微血管密度（MVD值）及肿瘤细胞凋亡指数。结果PCR及测序鉴定证实重组质粒pEGFP-C1IL-12构建成功,RT-PCR及Westernblot法证实重组质粒在HepG2细胞内正常表达。转染重组质粒后的肝癌细胞生长未受明显影响,表达VEGF能力无显着变化。所提纯的白芨多糖为一种不含阳离子基团的非还原性多糖,通过胺化还原反应的方法可成功制备出含伯胺基的阳离子型多糖,红外光谱证实了多糖上伯胺基的存在。该阳离子型多糖可以结合并保护质粒DNA免受DNA酶的降解,体外实验证实该复合物可以转染入体外培养的肝癌细胞,以阳离子白芨多糖作为转染载体时转染效率要低于脂质体,差异具有统计学意义（28.87%±3.27% vs 36.64%±6.87%,t检验,P<0.05）。采用介入方法经肝动脉给药时复合物能靶向转染入活体兔肝细胞内并实现表达,阳离子白芨多糖未显示出明显体内毒性。体内实验中,C、D组于第3、7天出现高水平IFN-γ的表达,明显高于治疗前水平及同期A、B组（Turkey HSD法方差分析,P<0.05）,至第14天血清IFN-γ水平恢复至治疗前水平。两个基因治疗组（C组和D组）的瘤组织VEGF和MVD水平均下降,但单纯基因治疗组（C组）的肿瘤生长速度及肿瘤细胞凋亡率与对照组相比均无显着差异（Turkey HSD法方差分析,P>0.05）,而基因治疗与化疗栓塞联合组（D组）肿瘤生长速度减慢,肿瘤细胞凋亡率增加,与对照组及化疗栓塞组相比均有显着差异。结论成功构建IL-12双亚基共表达质粒pEGFP-C1IL-12,该质粒转染入肝癌细胞后,表达产物对体外培养的肝癌细胞的生长及表达VEGF的能力无显着影响。通过胺化还原法制备的阳离子型白芨多糖可以结合并保护质粒DNA,该阳离子白芨多糖能作为基因递送载体携载质粒pEGFP-C1IL-12转染入体外培养的肝癌细胞及体内生长的肝细胞。经动脉IL-12基因治疗与化疗栓塞术联合应用能对VX2肝癌产生明显的抗肿瘤作用及抗肿瘤血管生成作用,联合应用的疗效明显优于化疗栓塞单独应用。

彭磷基^[10]（2009）在《扶正抗癌方、维生素C及两者联用防治肝癌作用的比较研究》文中指出目的:原发性肝癌起病隐匿,恶性程度高,病情变化快,死亡率高,是我国最常见的恶性肿瘤之一,目前临床上缺乏有效的治疗方法。因此,寻找疗效明显、毒副反应少、延长带瘤生存时间和提高带瘤生活质量的肝癌治疗方法是目前临床肿瘤学的研究难点。扶正抗癌方是笔者临床上用于治疗肝癌的中药验方;静脉注射维生素C（VC）是近年来在肿瘤基础研究和临床应用方面有潜在价值的研究热点之一。在前期临床研究结果及参考国外相关研究资料的基础上,本研究以Walker256移植性大鼠肝癌模型、二乙基亚硝胺（DEN）诱发性大鼠肝癌模型,及用体外培养的大鼠肝癌细胞（CBRH7919）和大鼠正常肝细胞（BRL）为研究载体,观察扶正抗癌方、VC及两者联用对大鼠肝癌发生、发展过程的干预作用,并进一步探讨其可能机制。方法:1.采用Walker256癌肉瘤细胞株接种SD大鼠制作原位移植肝癌模型,分为正常组、假手术组、模型组、中药低剂量组（扶正抗癌方水煎剂12.1g/kg灌胃）、中药中剂量组（扶正抗癌方水煎剂24.2g/kg灌胃）、中药高剂量组（扶正抗癌方水煎剂48.4g/kg灌胃）。定时记录体重、进食及饮水等一般状况;实验w1、w2、w3取材,检测血清总蛋白（STP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白球比值（A/G）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及肿瘤诊断指示酶碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）和岩藻糖苷酶（AFU）;称瘤重,测量瘤块长短径;取瘤组织行病理观察;记录肿瘤转移情况;观察各组大鼠的生存时间。研究不同剂量的扶正抗癌方对移植性大鼠肝癌的抑制作用,并探索最佳量效关系。2.制备Walker256移植性肝癌模型,分为正常组、假手术组、模型组、VC低剂量组（维生素C钠2.83g/kg静脉注射）、VC高剂量组（维生素C钠5.65g/kg静脉注射）。定时记录各组大鼠的一般状况;检测肝功能（STP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST、ALP、GGT、AFU）;称瘤重、测量瘤块长短径;取瘤组织行病理观察。研究静脉注射不同剂量VC对移植性大鼠肝癌的抑制作用。3.制备DEN诱发大鼠肝癌模型,分别给予扶正抗癌方48.4g/kg、维生素C钠2.83g/kg、扶正抗癌方48.4g/kg与维生素C钠2.83g/kg联用、化疗药优福定（UFT）0.09g/kg治疗。造模后w8、w14、w20取材,定时记录各组大鼠体重、进食饮水等一般状况;检测STP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST、ALP、GGT、AFU,观察各组大鼠肝功能的变化;检测外周血中CD4+/CD8+比值和白细胞介素2（IL-2）表达水平,了解机体的免疫功能状态;检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）表达量,了解大鼠肝脏氧化损伤和抗自由基能力;HE染色观察大鼠肝脏病理学变化;免疫组化法检测肝癌标记物甲胎蛋白（AFP）及肝癌组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达;运用PCR及实时定量PCR技术,分别检测p53基因突变情况和c-myc、cyclinD1的表达量;记录各组大鼠的生存时间。4.利用血清药理学方法制备扶正抗癌方、VC、扶正抗癌方与VC联用、UFT的大鼠含药血清,分别给予2.5%、5%、10%三个浓度的上述含药血清,应用CCK8法检测扶正抗癌方、VC、扶正抗癌方与VC联用、UFT含药血清培养不同时间（24h、48h、72h）对BRL细胞和CBRH7919细胞增殖的影响;选择对CBRH7919细胞有选择性杀伤作用的最佳含药血清浓度及血清孵育时间,运用流式细胞术进一步观察各组CBRH7919细胞周期及凋亡率的变化,并运用化学比色法检测各组CBRH7919细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达量的变化。结果:1.扶正抗癌方对大鼠Walker256移植性肝癌的抑制作用1.1不同剂量的扶正抗癌方在不同时间段保肝护肝作用肝功能结果显示:与模型组比较,实验w1,中药高剂量组AST降低（P＜0.05）。实验w2,低剂量组ALB、A/G升高（P＜0.05）,GGT降低（P＜0.05）,ALT、ALP显着降低（P＜0.01）;中剂量组ALB、A/G升高（P＜0.05）,ALT、ALP、GGT则显着降低（P＜0.01）;高剂量组ALB升高（P＜0.05）,A/G亦显着升高（P＜0.01）,ALT、ALP、GGT则显着低于模型组（P＜0.01）。实验w3,中药低剂量组ALT、AST、GGT降低（P＜0.05）,ALP则显着降低（P＜0.01）;中剂量组ALB较模型组升高（P＜0.05）,ALT、AST、ALP、GGT显着降低（P＜0.01）;高剂量组A/G升高（P＜0.05）,ALB亦明显高于模型组（P＜0.01）,ALT、AST、ALP、GGT、AFU则显着降低（P＜0.01）。1.2不同剂量的扶正抗癌方在不同时间段的抑癌作用实验w1-w3,中药各剂量组均能抑制肿瘤生长,其中高剂量组于实验w3时的肿瘤重量抑制率高于低剂量组（P＜0.05）。病理结果示,高剂量扶正抗癌方在肝癌早、中期（w1、w2）可抑制癌细胞向周围浸润,在肝癌晚期（w3）则能促进癌细胞坏死。实验w3,中药低、中、高剂量组肿瘤转移评分均低于模型组（P＜0.05）。1.3不同剂量的扶正抗癌方对大鼠生存时间的影响中药高剂量组大鼠的生存时间延长,与模型组比较有差异（P＜0.05）。2.维生素C对大鼠Walker256移植性肝癌的抑制作用2.1维生素C的保肝护肝作用VC低剂量组血清A/G高于模型组（P＜0.05）,ALT明显低于模型组（P＜0.01）,GGT亦低于模型组（P＜0.05）;VC高剂量组血清ALT亦低于模型组（P＜0.05）。2.2维生素C的抑癌作用VC抑制肿瘤体积和重量的效果不明显（P＞0.05）,但病理结果显示VC可促进肿瘤细胞坏死,其中VC低剂量组肝癌的坏死程度高于模型组（P＜0.05）。3.扶正抗癌方、维生素C及两者联用对DEN诱发大鼠肝癌的防治作用3.1不同时间段各组大鼠肝功能变化实验w8,中药组、VC组血清ALP较模型组降低（P＜0.05）,中药与VC联用不仅能显着降低ALP（P＜0.01）,还能抑制肝脏AST的释放,与模型组比较有差异（P＜0.05）。实验w14,中药、VC以及两者联用保肝护肝的作用更明显,其中中药组ALT、AST显着低于模型组（P＜0.01）,中药还能抑制肝脏GGT的合成,含量较模型组降低（P＜0.05）;与模型组比较,VC组、中药+VC组ALT降低（P＜0.05）,AST显着降低（P＜0.01）,此外还可改善蛋白合成功能,其中VC组STP、GLB回升（P＜0.05）,中药+VC组作用更明显,STP、GLB显着高于模型组（P＜0.01）。随着肝癌的进展,实验w20,中药仍能抑制肝脏释放AST,表达量低于模型组（P＜0.05）;中药+VC组AST显着低于模型组（P＜0.01）,且ALT亦低于模型组（P＜0.05）,化疗组各指标与模型组比较无差异（P＞0.05）。3.2不同时间段各组大鼠肝癌进展的比较病理结果显示中药、VC及两者联用可延缓癌变进展,在诱癌晚期还可以促进癌细胞坏死,UFT亦能促进癌细胞坏死。此外,w8,w14时,中药+VC组AFP低于模型组（P＜0.05）,w20时,中药+VC组AFP进一步降低,较模型组差异显着（P＜0.01）,且明显低于化疗组（P＜0.05）;此时中药+VC组大鼠的体重/肝重比值比模型组回升（P＜0.05）。3.3不同时间段各组大鼠免疫功能变化肝癌大鼠存在一定的细胞免疫障碍,表现为CD4+/CD8+比值减少,且免疫增强因子IL-2表达降低。实验w8,VC能使肝癌大鼠的CD4+/CD8+比值回升（P＜0.05）,中药、中药与VC联用的效果更明显,CD4+/CD8+比值显着高于模型组（P＜0.01）;w14时,中药+VC组CD4+/CD8+比值亦明显高于模型组（P＜0.01）;实验w20,与模型组比较,中药、中药与VC联用不仅能显着增加CD4+/CD8+比值（P＜0.01）,还能使血清IL-2表达增加（P＜0.05）。3.4不同时间段各组大鼠氧化损伤程度大鼠饮用DEN后,肝脏MDA表达量增加。给予药物治疗后,实验w8,VC组和中药+VC组MDA表达减少（P＜0.05）;实验w14,中药组SOD分泌增加（P＜0.05）,VC组和中药+VC组SOD显着增加（P＜0.01）;实验w20,中药组、VC组、中药+VC组、化疗组MDA均显着低于模型组（P＜0.01）,且中药组SOD、GSH-PX表达增加（P＜0.05）,VC、中药与VC联用增加SOD、GSH-PX的作用更明显,其表达量显着高于模型组（P＜0.01）。3.5不同时间段各组大鼠VEGF表达量变化免疫组化方法检测各组肝脏VEGF表达,结果显示,实验w8时VC组、中药+VC组VEGF表达量明显降低,与模型组比较有显着差异（P＜0.01）,中药组VEGF表达量亦下降（P＜0.05）;实验w14,中药组、VC组、中药+VC组均能显着抑制VEGF表达（P＜0.01）;在诱癌晚期（w20）中药+VC组VEGF不仅低于模型组（P＜0.05）,亦低于化疗组（P＜0.05）。3.6不同时间段各组大鼠p53突变率及c-myc、cyclinD1表达量DEN诱发的大鼠肝癌p53突变率高,并存在多处突变点,w14时,中药、VC、中药与VC联用均能减少其突变点（P＜0.01）;此外肝癌大鼠的c-myc、cyclinD1基因表达量随着癌变进展逐渐增加,中药、VC、中药与VC联用以及UFT均能减少c-myc、cyclinD1的表达,其中中药与VC联用效果最佳,在实验w20,中药+VC组c-myc、cyclinD1的表达量分别约为模型组的1/18、1/16。3.7各组大鼠生存时间比较中药组和中药+VC组大鼠的生存时间较模型组延长（P＜0.05）,且中药+VC组大鼠生存时间长于化疗组（P＜0.01）,中药组大鼠生存时间亦长于化疗组（P＜0.05）。4.扶正抗癌方、维生素C及两者联用对大鼠肝癌细胞增殖、周期、凋亡的影响5%的中药组、VC组、中药+VC组、化疗组含药血清作用48h能选择性抑制CBRH7919细胞增殖,其中中药+VC组的作用显着优于中药组和化疗组（P＜0.01）。中药组含药血清能使CBRH7919细胞G1期比率高于空白血清对照组（P＜0.01）,使细胞增殖阻滞在G1期;VC组、中药+VC组含药血清均能使CBRH7919细胞S期比率显着升高（P＜0.01）,化疗组含药血清亦能使CBRH7919细胞S期比率升高（P＜0.05）,使细胞增殖阻滞在S期。中药组、VC组、中药+VC组和化疗组含药血清使Caspase-3表达增加（P＜0.05）,并诱导CBRH7919细胞凋亡,中药+VC组、化疗组凋亡率较空白血清对照组显着升高（P＜0.01）,其效果优于中药组（P＜0.01）和VC组（P＜0.05）。结论:1.扶正抗癌方、VC及两者联用对大鼠肝癌有防治作用,主要表现在保护肝功能、抑制肝癌细胞的增殖、抑制肝癌的生长、抑制AFP表达、改善大鼠的带瘤生存状态及延长生存时间等方面。2.扶正抗癌方与VC联用抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡的效果优于扶正抗癌方、VC单用;与化疗药UFT相比,扶正抗癌方及扶正抗癌方与VC联用在延长大鼠带瘤生存时间方面效果更明显;此外,扶正抗癌方与VC联用能抑制肝脏AFP、VEGF表达,效果亦优于化疗药UFT。3.扶正抗癌方、VC及两者联用防治肝癌的作用机制可能与以下几方面有关:3.1提高血清CD4+/CD8+比值,增加IL-2的表达,从而增强机体的细胞免疫力;3.2增强肝脏SOD、GSH-PX的活力,减少MDA的表达量,从而提高大鼠肝脏的抗自由基能力,减轻肝脏的氧化损伤;3.3降低肝脏的VEGF表达量,进而抑制肝癌的血管生成;3.4降低c-myc、cyclin D1的表达,阻滞肝癌细胞生长周期,抑制肝癌细胞的增殖;3.5抑制抑癌基因p53的突变,增加Caspase-3表达,促进肝癌细胞凋亡。

二、白细胞介素12及白细胞介素2对大鼠肝癌的联合基因治疗研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、白细胞介素12及白细胞介素2对大鼠肝癌的联合基因治疗研究（论文提纲范文）

（1）白藜芦醇对肿瘤自杀基因系统的增效作用（论文提纲范文）

（2）逆转录病毒介导人白介素-2基因转染肝干细胞的实验研究（论文提纲范文）

（3）白细胞介素18及其基因的应用研究进展（论文提纲范文）

（4）脾内转染人IL-2与鼠IL-12融合基因对大鼠诱发肝癌的治疗作用（论文提纲范文）

（6）脾内转染白细胞介素12与白细胞介素2融合基因治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）

（8）六味地黄丸入血成分及山奈酚对自杀基因系统杀伤肝癌细胞的增效作用（论文提纲范文）

（9）动脉内IL-12基因治疗联合化疗栓塞术治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）

（10）扶正抗癌方、维生素C及两者联用防治肝癌作用的比较研究（论文提纲范文）

四、白细胞介素12及白细胞介素2对大鼠肝癌的联合基因治疗研究（论文参考文献）

• [1]白藜芦醇对肿瘤自杀基因系统的增效作用[D]. 赵青. 广州中医药大学, 2014(01)
• [2]逆转录病毒介导人白介素-2基因转染肝干细胞的实验研究[D]. 郑和鸣. 浙江大学, 2007(02)
• [3]白细胞介素18及其基因的应用研究进展[J]. 闫芳,李宪超. 临沂医学专科学校学报, 2005(02)
• [4]脾内转染人IL-2与鼠IL-12融合基因对大鼠诱发肝癌的治疗作用[J]. 范瑞芳,杨家和,柴福录,卫立辛,吴孟超,钱其军,尤天庚,薛惠斌. 解放军医学杂志, 2005(04)
• [5]逆转录病毒介导白细胞介素12及白细胞介素2基因联合治疗大鼠肝癌[J]. 杨家和,范瑞芳,钱其军,尤天庚,薛惠斌,苏长青,曹惠芳,吴孟超. 第二军医大学学报, 2003(07)
• [6]脾内转染白细胞介素12与白细胞介素2融合基因治疗肝癌的实验研究[J]. 杨家和,范瑞芳,钱其军,尤天庚,薛惠斌,苏长青,曹惠芳,吴孟超. 中华医学杂志, 2003(09)
• [7]白细胞介素12及白细胞介素2对大鼠肝癌的联合基因治疗研究[J]. 杨家和,范瑞芳,钱其军,尤天庚,薛惠斌,苏长青,曹惠芳,吴孟超. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2002(04)
• [8]六味地黄丸入血成分及山奈酚对自杀基因系统杀伤肝癌细胞的增效作用[D]. 周瑶. 广州中医药大学, 2010(10)
• [9]动脉内IL-12基因治疗联合化疗栓塞术治疗肝癌的实验研究[D]. 夏向文. 华中科技大学, 2010(11)
• [10]扶正抗癌方、维生素C及两者联用防治肝癌作用的比较研究[D]. 彭磷基. 暨南大学, 2009(09)

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